最近，基因增补疗法在神经系统疾病的诊疗方面取得了显著进步，腺相关病毒（AAV）是常用的载体之一。然而研究结果却参差不齐，一部分临床试验显示AAV基因疗法能够显著延缓疾病的进展，而有部分临床试验疗效甚微，甚至出现毒性反应。与传统的小分子药物开发不同，AAV基因疗法的疗效取决于AAV衣壳的嗜性和治疗性基因的表达效果。

随着相关临床项目的开展，人们越来越了解影响将临床前研究转化为人类治疗的因素，包括给药途径、治疗时机、免疫反应以及可用模型系统的局限性。同时，该领域也正在开发潜在的解决方案以减轻不良反应，包括AAV衣壳工程和调节治疗性转基因表达的设计。与此同时，临床前研究正在探索基因增补疗法的新领域，重点关注线粒体疾病和神经发育障碍。

2023年9月1日，来自美国UT Southwestern医学中心Steven J. Gray博士等人，发表在Nature reviews drug discovery期刊上的综述文章“AAV-based in vivo gene therapy for neurological disorders”, 向我们系统阐述了AAV介导的神经系统基因增补疗法的现状，包括优化治疗安全性和有效性的关键因素，以及该领域存在的局限性。

 

1.介绍

20多年前，第一例针对神经系统疾病的AAV基因治疗临床试验在Canavan病中开展。Canavan病是一种罕见的致命遗传性疾病，由乙酰天冬氨酸酶（ASPA）基因缺陷导致。该临床试验采用rAAV2载体递送功能性ASPA基因，结果显示该疗法安全且能一定程度上改善症状。过去几十年里，为了将基因治疗应用于神经系统疾病，研究者主要集中在体内基因治疗方法上，递送途径主要包括微创性的静脉注射和高侵入性的脑实质内（IPa）注射。结合合适的载体（AAV衣壳）最终将基因增补、基因沉默或者基因编辑后的转基因盒递送到特定神经系统区域，从而纠正单基因甚至多基因遗传性疾病。

本文重点介绍基因增补策略的现状。目前，有超过300项临床试验（已完成和正在进行的）使用AAV作为基因递送载体，其中约1/3适应症为神经系统类疾病。几款AAV基因治疗药物Luxturna、Zolgensma和Upstaza的接连上市极大促进AAV基因治疗的发展。相对于其他治疗策略，基因增补的发展最为成熟。因此本文总结了AAV作为基因治疗载体的演变历程，概述了具有代表性的AAV基因增补治疗临床试验，讨论了将候选基因治疗转化为临床试验的考量因素。此外，还强调了在神经系统基因增补治疗新领域（线粒体疾病与神经发育障碍）的前沿与挑战。

 

图1 基因替代和补充疗法（图片来源：Ling, Q et al., Nat Rev Drug Discov, 2023）

2.AAV载体设计

AAV因其整合到宿主基因组概率低、低免疫原性、特定的组织嗜性以及较高的转导效率，被视为是一种理想的基因递送载体。野生型（WT）AAV衣壳由60个亚基组成，包裹着长约4.7kb的单链DNA（ssDNA）基因组。基因组包含REP（复制）和CAP（衣壳）基因的主要病毒开放阅读框（ORF），两侧有两个末端反向重复序列（ITRs）。通过将REP和CAP替换为目的基因和调控元件的序列，产生重组AAV（rAAV），从而实现转基因递送。用于治疗神经系统疾病的理想rAAV需要具有对CNS高效转导和穿过血脑屏障的能力。rAAV9可以满足这一标准，因此在神经学领域备受青睐。此外，通过对野生型AAV衣壳进行改造，可以提高细胞组织趋向性并减轻毒性。然而，需要进一步研究来探索和验证新衣壳变体的效率和安全性。

不同的AAV血清型表现出独特的特异性和转导效率，这是由靶细胞表面的AAV受体决定的。AAV载体首先被宿主细胞表面的糖基化受体识别，通过内吞作用进入细胞。进入细胞后，通过细胞骨架网络进行AAV载体的细胞质传输。然后AAV颗粒通过核孔复合体进入细胞核并完成去衣壳过程。AAV胞内运输的过程尚不完全清楚，在将其基因组传递到细胞核的效率可能有所不同。因此研究细胞结合、胞内运输和脱壳机制对提高AAV的细胞组织趋向性，增强细胞特异性和转导效率具有重要作用。

通过改造AAV ITR区域，将ssDNA转变为scDNA，省去单链DNA复制成双链DNA的步骤，加速转基因表达。但是相应的，scAAV只能容纳ssAAV一半的转基因的长度。

 

图2 AAV载体设计（图片来源：Ling, Q et al., Nat Rev Drug Discov, 2023）

 

3.CNS基因增补的临床试验

Zolgensma是第一款由FDA批准的神经系统疾病SMA治疗药物，利用AAV9载体携带SMN基因，通过单次静脉注射，使患者体内持续表达SMN蛋白，从而达到治疗疾病的目的。Zolgensma的成功促进了神经系统疾病领域基因治疗的发展，越来越多临床试验正在进行中。

 

表1 正在进行的针对神经系统疾病的基于AAV的基因补充临床试验
（数据来源：Ling, Q et al., Nat Rev Drug Discov, 2023）

给药途径在CNS疾病治疗中也扮演重要角色。SMA采用全身静脉给药，该给药途径目前也应用于GM1神经节苷脂沉积症的临床试验中。正在进行的三项临床试验旨在评估使用AAV9、AAVrh.10及AAVhu.68载体携带功能性β-gal拷贝进行全身或CNS特异性递送的疗效和安全性。通过脑脊液（CSF）注射AAVrh.10的一项Ⅰ/Ⅱ期临床试验的数据显示，该疗法增加了CSF中β-gal的活性，而且给药1年后未出现不良反应事件。

鞘内腰椎穿刺（IT-LP）给药也被用于多种疾病，比如巨轴索神经病（GAN）。AAV9/GAN基因补充疗法是第一个使用IT-LP作为给药途径的临床试验。初步数据表明病人在给药后运动功能能够相对较好保留。IT-LP也被用于SMA、LSD、GM2神经节苷脂沉积症以及阿兹海默症等的临床试验中。一项正在进行的GM2神经节苷脂病临床试验（NCT04798235），将含有HEXA和HEXB基因的AAV9载体通过单次IT-LP给药，旨在评估该疗法的安全性和有效性。

其他的脑脊液内（intra-CSF）给药途径，包括枕大池内给药（ICM）和脑室内给药（ICV）以及其他途径联合给药方式，也正在临床试验中进行评估。其中编号为NCT05317780的临床试验，一名Canavan病患者接受了静脉和ICV联合给药治疗，这种全身和局部的联合给药方式能够转导CNS和外周器官，因此可以实现最大化基因治疗的疗效。另外一项针对1型GM2神经节苷脂沉积症的临床试验，两名年幼患者接受了等摩尔的AAVrh8-HEXA和AAVrh8-HEXB组合基因治疗，其中一名采用IT-LP（占总剂量的25%）和ICM（占总剂量的75%）联合给药方式，另一名则采用IT-LP和IPa联合给药方式。尽管病人脑脊液中的HEXA蛋白活性都得以增强，但第二位病人在基因治疗干预后六个月仍然出现了癫痫发作。这些研究证明使用多种给药途径的总体安全性，但是注射方式的选择也十分重要。

 

图3 CNS基因治疗的给药途径（图片来源：Ling, Q et al., Nat Rev Drug Discov, 2023）

4.基因疗法成功转化为临床试验的考量因素

为使基因治疗成功进入临床试验，适应不同疾病类型和病理过程，需要考虑多种因素，如给药剂量、给药途径和给药时间等。对于一些神经退行性和发育类疾病，基因治疗的窗口期选择尤为重要。给药途径会显著影响基因疗法的治疗效果和潜在不良事件。不同的给药途径选择取决于疾病的特性和AAV载体的转导效率。治疗干预的时机可以极大地影响基因治疗的疗效。基因治疗中AAV衣壳、转基因盒和/或治疗性蛋白引起的宿主免疫反应的触发需重点关注。免疫抑制如皮质类固醇和雷帕霉素治疗已被广泛纳入，其他逃避AAV免疫的新方法正在临床前和临床试验中，例如，非甲基化胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG）消耗可以作为一种基因组修饰来促进免疫逃避。动物疾病模型在评估基因疗法的效力和安全性方面起着关键作用。转基因动物模型，特别是小鼠和大鼠，常用于临床前研究。由于小鼠和人类之间的遗传差异，创建一个模拟人类疾病的模型有时可能具有挑战性，特别是对于罕见病而言。由于物种之间的普遍差异，非人灵长类动物（NHPs）是成为评估AAV免疫原性和载体生物分布的首选模型。但是，围绕在科学研究中使用NHPs存在伦理争议。因此，需要开发更好的体内和体外疾病模型，如类器官，以及扩大我们对动物模型和人类疾病之间差异的理解。

 

5.CNS基因增补治疗的新领域

原发性线粒体疾病是一组罕见疾病，由核基因组或线粒体基因组(共编码13种蛋白质)编码的线粒体蛋白发生异质基因突变引起，导致线粒体缺陷。针对原发性线粒体疾病开发基因疗法面临的挑战包括:开发理想的动物模型，在多器官系统中实现最佳表达，将治疗基因导入线粒体，以治疗由线粒体DNA突变引起的疾病。最近的一项研究表明，在Slc25a46基因敲除小鼠模型中，AAV的早期全身治疗可以减轻神经系统表型。其他具有神经系统表现的线粒体疾病也已显示出从基因治疗干预中获益，包括其他形式的Leigh综合征、乙基丙二酸脑病和线粒体神经胃肠道脑肌病。

神经发育障碍是一类广泛的疾病，正在进行基因增补治疗评估。这种方法对许多神经发育障碍的治疗效果一直存疑，部分原因是它们通常在早期发育阶段表现出来，疾病可逆性的潜力尚不清楚。尽管如此，研究者仍对几种神经发育障碍进行了临床前研究。研究表明，基于AAV1的基因治疗可以改善Prader–Willi综合症模型小鼠的认知和行为功能。针对Rett综合症的致病基因是MECP2，通过整合microRNA结合位点从而防止MECP2过度表达可以延长mecp2敲除小鼠的寿命。另外一种策略是整合一段3’UTR序列产生不稳定的MECP2基因，也可以防止MECP2过度表达。考虑到rAAV有限的包装能力，蛋白质同分异构体导致的疾病更具有挑战性。例如，Angelman综合症的致病基因UBE3A有两种不同的表达异构体。一些研究者通过操纵Kozak sequence来选择性地调节两种蛋白质的表达，从而模拟内源蛋白的表达比例与模式，起到基因治疗的目的。另外针对Dravet综合症的治疗，通过整合合适的增强子，3’UTR和内含子序列，从而实现SCN1A功能域在特定神经元的表达。在处理这些疾病时，研究人员面临着多个挑战，包括早期症状的表现、剂量敏感性和蛋白质异构体的存在。为了克服剂量敏感性问题，已经开展了一些创新的设计，包括使用自调节基因补充治疗方法，以及通过调节转录和翻译的方法来控制蛋白质的表达水平。

 

6.潜在的神经系统安全性问题

虽然AAV相对于其他病毒载体具有较高的体内安全性，包括较低的免疫原性和最小的宿主基因组整合，但仍然存在一些潜在的安全问题。最普遍的副作用是肝毒性。这主要是由于高剂量的rAAV和预先存在的肝脏疾病所引起的。在AAV治疗的患者中观察到并发症血栓性微血管病（TMA），其特征是小动脉和毛细血管内皮病理和微血管血栓形成，可能导致包括大脑在内的多个主要器官的缺血。通过静脉给药接受AAV9/SMN治疗的SMA患者中，有9例在治疗后1周发生TMA，并伴有免疫补体激活。治疗后3个月报告1例死亡病例。虽然TMA与AAV大剂量全身递送的确切机制尚不清楚，但它与补体激活有关。脊神经节（DRG）病变已被广泛描述为脑脊液内或静脉注射AAV治疗的NHPs的主要组织病理学发现。在临床试验中，一名家族性肌萎缩性侧索硬化症患者，通过IT-LP给药接受了4.2×10¹⁴vg的AAV基因治疗，患者出现感觉神经病变，并与治疗后15.6个月观察到的DRG神经元丧失相关。临床前研究中观察到的DRG病理可能与转基因的过表达有关，因为在表达的转基因mRNA中包含DRG特异性miRNA结合位点（特异性沉默DRG的表达）可以防止NHPs中DRG的毒性。通过IPa给药将AAV载体直接递送到特定脑区是局部靶向中枢神经系统细胞的有效方法。然而，根据脑部MRI结果，这种给药途径可能会导致局部炎症。

 

7.提高AAV的疗效与安全性

优化AAV衣壳设计：不同的AAV血清型在衣壳组成和结构上有所不同，决定了其与细胞表面受体的结合能力强弱。研究人员可以通过引入特定的突变来改变衣壳组成，以实现更高的感染水平、降低免疫原性和增加细胞特异性。

修饰转基因盒：可以使用细胞特异性启动子或调控元件（如增强子）对转基因盒进行修饰，以确保该结构在预期的细胞类型中表达。启动子是细胞靶向的最常见选择。细胞特异性启动子用于驱动基因载体盒在特定细胞类型中的表达，同时限制在非靶细胞或器官中的表达。

转基表达调控：通过RNAi调节转基因在靶细胞上的表达，以及在肝脏、DRG等高转导效率的非靶区域限制转基因的表达，可以实现转基因表达调控。了解哪种细胞类型表达某种miRNA可以实现更有针对性的基因治疗方法。

优化密码子：对于密码子优化，将低效的密码子替换为翻译效率更高、翻译质量更好的密码子，从而提高蛋白质的表达，该过程还可以去除转基因开放阅读框中的隐性剪接位点或替代起始密码子。

 

 

图4 减轻AAV非靶向作用和毒性（图片来源：Ling, Q et al., Nat Rev Drug Discov, 2023）

表2 中枢神经系统靶向AAV基因治疗的不良反应（数据来源：Ling, Q et al., Nat Rev Drug Discov, 2023）

 

 

8.总结展望

神经系统疾病基因治疗仍在不断发展中，最终是希望开发出安全有效的基因疗法。首先，改进AAV衣壳将有利于更特异性的细胞靶向能力或提高血脑屏障的转导效率，从而提高治疗效果，同时减少脱靶毒性。其次，随着CRISPR和其他基因编辑技术的发展，虽然仍需不断提高编辑效率、减轻脱靶效应，但个性化和个体化的基因疗法将能在不久实现。在需要严格控制转基因表达水平的情况下，应探索利用内源性miRNA靶向位点和细胞特异性基因表达调控元件等调控转基因表达的途径。最后，我们需要深入探索如何管理针对载体和转基因的免疫反应，这可能会潜在地改善治疗效果或提供基因治疗再给药的可能性。需要强调的是，早期干预对神经疾病的治疗至关重要。及早诊断和治疗可以最大程度地提高治疗效果，保持患者的正常发育轨迹或防止疾病的进一步恶化。相信随着基因治疗的成熟与普遍，将会有越来越多的患者受益，神经疾病领域的基因治疗将有更广阔的发展前景。

 

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41573-023-00766-7