近日，AAV基因疗法公司Taysha Gene Therapies（Taysha）宣布完成1.5亿美元融资，绝地逢生，股价涨幅超200%。Taysha是一家专注于开发和商业化基于AAV的基因治疗产品的临床阶段基因治疗公司，以消除单基因中枢神经系统（Central nervous system，CNS）疾病为己任。该公司有多条基因治疗研发管线，其中，用于治疗瑞特综合征的自我互补鞘内给药AAV9基因替代疗法TSHA-102在Ⅰ/Ⅱ期临床试验中获得了令人满意的结果。据悉，FDA已对其授予快速通道资格。

 

 

Taysha基因治疗研发管线（图片来源：Taysha官网）

 

神经系统疾病是全球致残的主要原因和第二大死亡原因，多种疾病是由于遗传基因突变导致神经和神经元功能异常引起。由于血脑屏障（Blood-brain barrier，BBB）的存在限制了传统药物治疗的有效性，使CNS疾病的新药研发尤为困难。基因疗法“一次治疗，终生有效”的优势为CNS疾病患者带来治愈的希望。随着AAV基因治疗药物Zolgensma（用于治疗脊髓性肌萎缩症SMA）和Upstaza（用于治疗芳香族L-氨基酸脱羧酶缺乏症）的接连上市，更加提高了人们的期望。

然而，事物的发展并非一帆风顺。AAV基因疗法的临床疗效仍会受到免疫原性、致病性等因素的限制。本期为大家带来发表在Journal of Controlled Release上的综述——AAV vectors applied to the treatment of CNS disorders: Clinical status and challenges。文中概述了AAV基因治疗在14种CNS疾病中的临床研究进展、存在的瓶颈和解决方案。从病毒载体技术、给药途径、免疫抑制和其他相关临床因素几个方面，阐述了提高AAV基因疗法在CNS疾病中安全性和有效性的策略，以期能有助于临床前研究的高效转化和临床试验的广泛运用。

 

 

图形摘要（图片来源：Kang L et al., J Control Release, 2023）

 

1.病毒载体的开发

1.1 AAV衣壳蛋白开发

rAAV衣壳能够有效地穿过BBB，并可在神经系统中提供安全、长期的表达，已成为CNS基因治疗的首选载体。迄今为止，临床研究中使用较多的血清型主要有AAV1、AAV2、AAV5、AAV8、AAV9和AAVrh10。然而，由于递送效率低等原因，AAV在全脑表达的效果不佳，开发高感染效率的新型AAV载体仍是值得关注的问题。新衣壳蛋白的开发策略不断演变，目前主要为：天然发现、合理设计和定向进化。

天然发现是指从天然来源wtAAV中分离出来的血清型。已上市的四种AAV基因治疗产品均是基于天然发现——AAV1（Glybera）、AAV2（Luxturna）、AAV9（Zolgensma）、AAV2（Upstaza）。由于大多数人预先存在针对某些AAV血清型的结合抗体，因此从非人灵长类动物中分离出的衣壳显示出巨大的前景。

合理设计是指将有益的衣壳序列添加到某些AAV血清型的已知受体结合域，从而增加衣壳的组织嗜性，提高转导效率，并降低免疫应答。合理设计的难点主要在于对AAV与细胞表面受体结合、内化、运输、脱壳以及进行基因表达的生理过程还不够了解。

定向进化是指在衣壳蛋白中引入大量随机突变。构建衣壳突变体库的方法有三种：随机插入寡核苷酸序列、DNA改组和易错配PCR。定向进化利用遗传多样性来改善生物分子的功能，已经成功发现了CNS定向衣壳，如AAVrh10。

总之，目前临床研究中最安全、最广泛使用的仍是基于天然发现的衣壳蛋白。基于定向进化的衣壳蛋白可以满足多样化的临床需求，在将来的临床试验中具有广阔的应用前景。

 

 

图1 AAV衣壳蛋白开发策略。A. 天然发现，B. 合理设计，C. 定向进化。

（图片来源：Kang L et al., J Control Release, 2023）

 

1.2 标准化载体生产

标准化载体生产是保证rAAV质量和数量以满足大量临床试验需求的重要环节。三质粒瞬时转染HEK293细胞系平台使用最为广泛。但该方法存在可放大性方面的问题。为提高生产效率和稳定性，已经开发了各种rAAV生产平台。如杆状病毒表达载体系统（Bac/Sf9）和辅助病毒（如腺病毒，HSV）/哺乳动物细胞（如HeLa细胞）系统。

纯化过程的目的是去除可能引起免疫反应和影响临床疗效的杂质。在临床实践中，最常用的纯化程序是将传统方法（氯化铯/碘克沙醇密度梯度离心，亲和层析）和新技术（疏水层析HIC、阳离子层析，切向流过滤TFF）结合起来，以实现稳定的生产。rAAV的安全性在很大程度上依赖于产品的表征和生产工艺的监测，但对于最优AAV载体质量的关键工艺步骤仍缺乏行业共识。目前业内已开发出灵敏、特异及准确的检测含量、效价以及纯度等指标的方法。

 

图2 rAAV载体生产工艺。A. rAAV生产平台，B. rAAV载体纯化，C. rAAV载体QA。

（图片来源：Kang L et al., J Control Release, 2023）

 

2.给药途径

脑实质给药利用立体定向手术系统将高浓度的载体跨越BBB送达到目标区域，是最受欢迎的CNS给药途径，其优点是可直接靶向目标脑区，已成功应用于纹状体、丘脑、尾状核、白质、黑质等脑区，给药剂量范围为10⁹-4.7×10¹²vg。缺点是给药范围有限且是一种侵入性的过程，可能引起额外的病理变化。临床上已经开发出许多其它策略来改善病毒的分布，如对流增强给药（Convection-enhanced delivery，CED）、与肝素或甘露醇同时给药、与磁共振成像造影剂同时给药等。

脑脊液内给药的优点是可将治疗基因在大脑或脊髓中表达更广泛。缺点是由于范围更广，会引起更严重的免疫反应。给药方式有三种途径：鞘内、脑室内和枕大池内给药。鞘内给药是最不侵入性的脑脊液内给药方法，通过腰椎穿刺将AAV送至脊髓。脑室内给药是指穿过脑实质的室腔，将AAV送至大脑，目前仅在黏多糖症Ⅲ型（MPS Ⅲ）的临床研究中使用。枕大池内给药可以使AAV广泛分布在小脑、脑干和脊髓中。与腰椎穿刺途径相比，枕大池内给药效率提高了100倍，但缺点是可能会导致针头插入髓质，造成脑干损伤。脑脊液内给药剂量范围为10¹²-4.2×10¹⁴vg。

静脉给药是最不具侵入性的给药方法。临床试验中使用的血清型主要是AAV9和AAVrh10，它们具有跨越BBB的能力。静脉给药剂量高达10¹⁵vg。由于静脉给药的主要靶点是肝脏，在全身暴露后可能出现免疫反应和肝毒性。然而，在成熟的免疫抑制策略的临床研究中，很少观察到这些不良反应。静脉给药的另一局限性是BBB的存在会降低给药效率。

综上所述，更大的给药范围可能伴随着更严重免疫反应，但也会带来更好的临床疗效。因此，在风险-收益的平衡中需要考虑多个参数。针对神经退行性疾病，局部给药途径是首选，因为其最大限度地提高了给药效果的同时最小化安全问题。脑脊液内给药是一种新兴的方法，可以实现广泛的给药范围。静脉给药是一种已成功应用于特定疾病的新方法。当一种给药途径过于受限或疾病影响多个CNS区域时，可以组合使用多种给药途径。

 

图3 AAV进入中枢神经系统及相关疾病的途径和衣壳蛋白。A. 中枢神经系统给药途径示意图，B. 不同临床给药途径所涉及的疾病和衣壳。（图片来源：Kang L et al., J Control Release, 2023）

 

3.宿主反应

AAV载体的免疫原性产生主要来自于三个方面：人体存在对于wtAAV的免疫记忆（基因治疗前已存在），AAV载体诱导的天然免疫和适应性免疫，基因转导产物诱导的免疫反应。预先存在的免疫原性在人类中普遍存在，大多数个体已感染wtAAV，因此他们的血浆中已经有抗体（IgG和IgM）和补体。当这些个体再次感染AAV，并且BBB被破坏时，其中一些抗体会中和AAV的衣壳蛋白，并阻碍基因转导效率。在不同的临床试验中，免疫策略、手术技术、BBB完整性、AAV制剂等存在差异。因此，中和抗体(NAb)滴度及疗效之间的相关性上没有统一的结论。

AAV载体引起的天然免疫反应较轻微且短暂，长期以来人们对AAV引起的天然免疫反应并未给予足够重视。然而，在基于AAV的基因治疗试验中出现的一些严重的不良事件，甚至导致死亡，使我们再次关注这一问题。这一领域的发展仍需优化分析方法和更丰富的专业知识。

适应性免疫发生在先天免疫之后，并持续很长时间，从而可以进行抗原特异性识别。适应性免疫主要由T淋巴细胞（T细胞）诱导。抑制T细胞功能的免疫抑制剂可有效避免适应性免疫的发生，包括皮质类固醇、西罗莫司、他克莫司、麦考酚酸酯或环孢霉素。

 

 

图4 AAV进入体内引发的宿主反应（图片来源：Kang L et al., J Control Release, 2023）

 

4.临床研究进展

4.1 神经退行性疾病

芳香氨基酸脱羧酶缺乏症（Aromatic L-amino acid decarboxylase，AADC）是由多巴胺脱羧酶双等位基因突变引起的常染色体隐性遗传疾病，导致多巴胺和血清素合成缺陷。Upstaza是一款用于治疗18个月及以上AADC缺乏症患者的药物，于去年7月获得EC上市批准。2012年，台湾进行了首次关于AAV基因治疗用于AADC缺乏症的研究，证明了其安全性和有效性。4例患儿（4-6岁）经4次双侧硬膜外注射1.6×10¹¹vg AAV2-hAADC后，结果显示患者未出现免疫相关症状且认知运动功能得到提升，多巴胺和血清素增加，以及对AADC在壳核中的摄取的增强。该组的进一步Ⅰ/Ⅱ期试验证实，10名患者（2-6岁）耐受了该疗法并显示出运动发展。研究结果还强调了早期治疗和高浓度3-甲氧基-4-羟基苯乙二醇的存在能促进更好的治疗效果，并且缺乏神经元特异性启动子不会限制治疗效果。2021年，美国一家公司通过CED方式将1.3×10¹¹-4.2×10¹¹vg AAV2-hADC安全输送到SNpc和VTA脑区，在SNpc中的覆盖率达到98%，VTA的覆盖率为70%，证明可以通过手术安全地将载体输送到大脑中，特别是SNpc和VTA脑区。

 

卡纳万病（Canavan disease）是由编码天冬氨酸酰化酶的ASPA基因突变引起，目前尚无有效疗法。卡纳万病是AAV在人脑中进行试验的第一个案例，该项研究最初关注的是免疫反应，10名患者经颅内注射1.09×10¹²-5.19×10¹² AAV2-ASPA，且未接受免疫抑制治疗。结果显示，7名患者在给药后未检测到中和抗体。10年随访期间，N-乙酰天冬氨酸在CNS的浓度下降，并且观察到部分患者脑萎缩停止甚至逆转的情况。此外，患者的运动功能和癫痫发作频率也有显著改善。5年内观察到生物标志物恢复和临床功能改善。值得注意的是，ASPA通常在小脑和脑干的少突胶质细胞中表达，进一步的给药应该集中在这些位置。

帕金森（Parkinson's disease，PD）是AAV基因治疗中临床研究最多的CNS疾病，目前PD的研究主要有三种策略：通过AADC诱导多巴胺生成、通过谷氨酸脱羧酶（GAD）抑制神经递质谷氨酰胺合成恢复基底神经节-丘脑-皮质环路平衡，以及通过黑质胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）保护黑质神经元。AADC治疗策略具有防止疾病进展的临床效果。在一项I期临床研究中，10名患者通过双侧壳核注射9×10¹⁰-3×10¹¹vg AAV2-hAADC并靶向纹状体介质棘神经元，在6个月随访期间观察到与手术相关的短期不良反应，而在4年随访期间观察到良好的耐受性和与剂量相关的运动障碍显著减少。为探索最佳的给药途径和剂量，15名中晚期难治性运动症状波动患者经壳核注射7.5×10¹¹、1.5×10¹²或4.7×10¹²vg AAV2-hAADC，结果显示剂量越大，覆盖率越广。在另一项I期临床研究中，将AAV2-GAD65和AAV2-GAD67注射到单侧丘脑底核中，未观察到与基因治疗相关的不良反应。一项将AAV2-NTN输送到壳核的I期临床试验显示出耐受性良好，但并未改善运动功能。总之，这些研究都显示出AAV基因治疗PD的安全性和耐受性，并且许多研究证实了AAV在特定脑区的表达。

阿尔兹海默病（Alzheimer's disease，AD）是常见的进行性神经退行性疾病，疾病进展与胆碱能神经元变性和淀粉样蛋白β（Aβ）斑块形成有关。除了免疫疗法外，目前还没有能够改善认知缺陷AD患者疾病进展的方法。在一项Ⅰ期临床研究中，研究人员使用AAV2载体递送NGF（编码神经生长因子）基因至AD患者Meynert双侧基底核，该试验证明了其安全性和长期性，但二期临床结果显示认知功能无明显变化。2022年3月3日，一家临床阶段的基因治疗公司LEXEO Therapeutics宣布，AAV基因疗法LX1001在治疗APOE4纯合AD患者的Ⅰ/Ⅱ期临床试验中获得积极数据。该疗法旨在将表达保护性载脂蛋白E2（APOE2）的转基因递送到携带两个APOE2等位基因的AD患者的中枢神经系统，以达到阻止和减缓疾病进展的作用。

巨轴索神经病（Giant axonal neuropathy，GAN）由编码巨轴突蛋白的基因突变引起，导致中间丝聚集和轴突肿胀。除了支持性护理外，尚无批准用于GAN的治疗方法。一项正在进行的I期临床研究，研究人员将3.5×10¹³vg AAV9/JeT-GAN通过鞘内给药输送至患者大脑和脊髓中，但其中一名患者在接受治疗八个月后死亡，可能与给药途径有关。

亨廷顿病（Huntington's disease，HD）是一种涉及CAG重复的常染色体显性遗传疾病，但基于AAV的治疗尚未报告任何结果。目前，多种策略致力于降低突变亨廷顿蛋白（mHTT）水平。在一项基于AAV基因治疗的Ⅰ/Ⅱ期临床研究中，26名患者接受6×10¹²-6×10¹³vg AAV5-mHTT双侧硬膜外注射给药，能够降低HD患者脑脊液中突变亨廷顿蛋白的表达水平，且耐受性和安全性良好。

4.2 神经肌肉疾病

脊髓性肌萎缩症(Spinal muscular atrophy，SMA)是一种常染色体隐性遗传的神经退行性疾病，95%的患者存在脊髓运动神经元1基因的缺失/突变，导致功能性SMN蛋白分泌不足，从而引起进行性运动神经元丧失。2019年，FDA批准了诺华公司的AAV基因治疗产品Zolgensma，用于治疗2岁以下的脊髓性肌肉萎缩症SMA。今年3月，诺华公布了Zolgensma的新数据，来自两项长期随访(LTFU)研究LT-001和LT-002的最新数据显示，Zolgensma在一系列患者群体中具有持续的疗效和耐久性，其总体获益-风险评估仍然良好。2016年，反义寡核苷酸药物Nusinersen获得FDA批准上市，可与AAV治疗联合使用。

肌萎缩性侧索硬化症（Amyotrophic lateral sclerosis，ALS）由超氧化物歧化酶1（SOD1）基因的常染色体显性突变导致SOD1蛋白质的错误折叠引起。两名ALS患者接受了鞘内注射4.2×10¹⁴vg rAAVRh10-mi-SOD1，以抑制突变基因。22岁的患者1虽然接受了泼尼松龙治疗，但鞘内注射后发生了类似于脑膜神经根炎的不良免疫反应。56岁的患者2接受免疫球蛋白和利妥昔单抗治疗后对鞘内给药产生了耐受。然而，目前关于其疗效的数据尚无定论。推测在这种情况下需要免疫抑制治疗或其他补充性研究，以进一步评估其潜力和持续的临床效果。

4.3. 溶酶体贮积症

庞贝病（Pompe disease）是由于α-葡萄糖苷酶基因突变导致体内糖原积累，从而影响神经和肌肉系统。基于AAV的基因疗法克服了传统治疗中的BBB穿透不足和长期疗效不佳的问题。目前，庞贝病基因治疗临床前和临床中的研究主要集中在AAV载体介导的体内基因治疗和LV载体介导的体外造血干细胞基因治疗。在一项Ⅰ/Ⅱ期临床研究中，7名婴儿型庞贝病患者接受了1×10¹²或5×10¹²vg AAV1-hGAA注射到膈肌中，在4年随访期间，利妥昔单抗和西罗莫司的免疫调节可以有效地抑制抗AAV1和抗α-糖苷酶，所有这些免疫反应都保持在稳定水平。研究还发现，结合AAV基因治疗和呼吸肌锻炼可以恢复呼吸可塑性。

家族黑蒙性痴呆（Tay-Sachs disease，TSD）由GM2神经节苷脂的异常代谢引起，一项基于AAV的治疗Tay-Sachs病的临床试验已经证明了安全性和有效性。目前只有两名Tay-Sachs患者接受了AAV基因治疗。第一例患者在30个月时分别接受1×10¹⁴vg的AAVrh8-HEXA和AAVrh8-HEXB注射到枕大池（75%）和胸腰交界处（25%）。另一例患者接受了相同载体剂量（4.2×10¹³vg），注射部位包括丘脑（7%）、枕大池（69.7%）和胸腰交界处（23%）。两例患者均接受免疫抑制治疗。注射过程耐受性良好，6个月随访期间未出现与载体相关的不良反应。两名患者的脑脊液中HexA活性增加，在一定程度上延缓或稳定了疾病进展。

黏多糖贮积症(Mucopolysaccharidosis，MPS)是一组由基因突变引起的隐性遗传疾病的统称。基于AAV的基因治疗已在MPS ⅢA和MPS ⅢB亚型中展现出治疗潜力。REGENXBIO公司正在进行的用于治疗MSPⅠ的Ⅰ/Ⅱ期临床试验，将1×10¹⁰或5×10¹⁰vg/g AAV9-L-iduronidase注射进5名患者体内，结果显示接受治疗的患者耐受性良好。该公司另一项用于治疗MSPⅡ的Ⅰ/Ⅱ期临床试验，将1.3×10¹⁰、6.5×10¹⁰或2.0×10¹⁰vg/g AAV9-I2S经肠内给药，纳入的9例患者在治疗后长达2年的时间内观察到脑脊液硫酸乙酰肝素和D2S6水平降低，所有患者均耐受性良好。一项关于MPS ⅢA的临床试验中，6名患者接受5×10¹²、1×10¹¹或3×10¹³vg/kg scAAV9-SGSH给药，36个月随访期间无严重不良事件发生，接受治疗的患者耐受性良好。MPS ⅢB的两项AAV基因治疗临床试验同样疗效显著，一项Ⅰ/Ⅱ期临床试验中，患者接受4×10¹²vg rAAV2/5-NAGLU治疗，并给予免疫抑制治疗。30个月随访期间，所有患者均表现出良好的安全性以及神经认知能力改善。在另一项Ⅰ/Ⅱ期临床试验中，9名患者接受了2×10¹³、5×10¹³或3×10¹⁴vg/kg scAAV9-5-NAGLU治疗，并接受泼尼松龙治疗。迄今为止，这些临床试验在系统指标方面均表现出积极的结果。

巴顿病（Batten disease，BD）又称神经元蜡样质脂褐质沉积症，是一种罕见的常染色体隐性神经退行性溶酶体贮积病，共有13个亚型，由13个编码溶酶体酶的基因突变引起。目前，有五项针对CLN2、CLN3、CLN6和CLN7的AAV临床试验正在进行中。此外，还完成了两项关于CLN2的研究，并显示AAV基因治疗的安全性和有效性。其中一项研究中，患者接受2.5×10¹² particle units AAV2-CLN2治疗，并给予免疫抑制治疗，尽管缺乏安慰剂/假手术对照和病理监测，但仍观察到疾病进展显著减慢。与酶替代疗法相比，AAV基因治疗在缓解神经退行方面效果较差。因此，目前已经开发了几种策略来提高AAV递送效率和临床效果，如结合不同治疗或递送方法、改进载体设计和剂量策略、增加剂量或重新给药。

异染性脑白质营养不良（Metachromatic leukodystrophy，MLD）是一种由溶酶体酶芳基硫酸酯酶A（ARSA）活性不足引起的罕见的常染色体隐性遗传病。基于AAV的基因治疗已在临床前研究中证明可以通过交叉校正来增加ARSA的表达。虽然AAV基因治疗已被证明对MLD患者是安全的，但目前无法改变疾病的进程。一项纳入4名（0.75-5岁）患儿参与的Ⅰ/Ⅱ期临床试验，将1×10¹⁴-4.2×10¹³vg AAVrh10-ARSA注射进白质中。在这项研究中，没有给予免疫抑制治疗，也没有观察到细胞免疫反应的证据。尽管ARSA活性恢复，但患者的症状继续恶化，导致研究终止。理论上，更高剂量或联合治疗可能带来更好的结果，但是高剂量的AAVrh10-ARSA会引起免疫应答，表明向CNS进行白质给药存在剂量限制。

GM1神经节苷脂贮积病（Gangliosidosis）是由GLB1基因的突变引起。一项临床前研究表明，基于AAV的基因治疗恢复了β-半乳糖苷酶的酶活性，降低了储存水平，并延长了寿命。目前正在进行3项Ⅰ期临床试验，分别是AAV9-GLB1、AAVrh10-GLB1和AAV Hu68-GLB1。

 

表1 CNS疾病AAV基因治疗临床试验

（来源：Kang L et al., J Control Release, 2023）

 

 

5.总结与讨论

AAV一直是CNS和大多数临床试验中最重要的基因递送载体。基于新的技术原理，尤其是对于儿童单基因CNS疾病，AAV介导治疗是安全和有效的。许多新兴的挑战凸显了进一步探索的必要，特别是在特定靶向载体、经济的生产工艺、安全的递送方法、明确的免疫机制和降低免疫反应的方法等方面。为了将基于AAV的基因治疗从单基因疾病扩展到其他疾病，我们必须了解每种疾病的完整表型谱，并确定客观生物标志物来捕捉疾病的显著特征。同时，还应该继续努力进行病毒载体的可视化研究，以追踪病毒的药代动力学。在这种情况下，确保基因组安全也非常重要。此外，人类和动物模型之间的体型差异、解剖特异性、免疫原性、疾病过程和基因组的差异影响了临床前研究的成功转化，如何建立更好的动物模型体系进行安全风险和临床效益评估需要进一步解释。尽管基因治疗在临床应用中仍面临许多困难，但随着研究人员在这一领域的不断深入，AAV基因治疗一定能在未来对CNS疾病的治疗中做出重大贡献。
劲帆医药专注打造一站式基因治疗药物CRO/CDMO服务平台，拥有规模300人的专业团队，核心团队成员在病毒载体研发、临床前药效评价、CMC工艺开发、QA/QC、GMP生产等环节均拥有多年丰富经验。自主研发的昆虫杆状病毒One-Bac 4.0系统专利技术平台，为AAV及蛋白药物规模化生产赋予全球领先规模化、高活性、高产率优势。目前，6400平米cGMP级车间（5条病毒载体生产线及1条灌装线）正在调试运行，将于2023年十月正式投入使用。劲帆医药在启动子、外壳和筛选方面，拥有多项领先的专利与技术开发平台。同时可提供药物筛选、药效学评价、药代动力学研究、Non-GLP非临床安全性评价等服务，已帮助客户成功申报多项国内外IND项目。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2023.01.067

【注】文中所有图片均来源于此文献：

Lin Kang, Shilin Jin, Jiayi Wang, Zhongyue Lv, Chengqi Xin, Chengcheng Tan, Mengke Zhao, Liang Wang, Jing Liu. AAV vectors applied to the treatment of CNS disorders: Clinical status and challenges.Journal of Controlled Release.2023,458-473.