根据EMA指南的定义，基因治疗药品(GTMP)由载体或递送制剂/系统组成，包含经过工程改造的基因构建物，以表达特定转基因，用于修复、调节、替换、添加或删除基因序列。基因疗法“一次给药，终身治愈”的理念，有巨大的临床应用前景。腺相关病毒（AAV）载体因具有免疫原性低、能有效地转导多种人体组织和细胞、基因组整合水平低等优势，现已成为治疗性转基因体内递送的首选病毒载体。当前共7种AAV基因疗法获批上市，分别是Luxturna、Zolgensma、Glybera、Roctavian、Upstaza、Hemgenix和Elevidys。

一种新型基因疗法在进行首次人体临床试验前，需要通过非临床项目，证明该疗法安全有效。在非临床研究中选择合适的动物物种至关重要，它能有效地将药物发现阶段产生的数据转化为临床数据，也能更好地向资助机构和监管机构提供有关新型AAV基因疗法的安全性信息。近日，来自英国的研究团队Mark Singh等人在Gene Therapy上发表了题为“Selection of appropriate non-clinical animal models to ensure translatability of novel AAV-gene therapies to the clinic”的综述，系统论述了如何选择合适的动物模型进行非临床研究，并提供了一个涵盖非临床动物模型选择过程中需要考虑的主要问题的图表，以期推动新型AAV基因疗法的发展。

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1.基因治疗适应症

最初，基因治疗着眼于单基因疾病。例如亨廷顿病(Huntington's disease，HD)，一种罕见且无法治愈的常染色体显性神经退行性疾病，其特征是进行性运动、认知和行为功能障碍。HD的发生是由于CAG重复扩增(40次或更多)，导致HTT基因编码的亨廷顿蛋白中形成多聚谷氨酰胺束。最近的研究表明，使用CRISPR/Cas9编辑扩增的CAG序列可以逆转在HD转基因R6/2小鼠中观察到的表型异常。这一系列研究已经证明了靶向特定基因或通路的治疗潜力。除了单基因疾病外，基因治疗的适应症也扩展到其他更复杂疾病，如癌症。

病毒载体是基因疗法的关键钥匙，其中AAV以安全性优势已成为体内基因治疗的首选病毒载体。目前已被EMA/FDA批准上市的6种AAV基因治疗产品见表1。【编者更新：截至2023年11月，共有7种AAV基因治疗产品获批上市。于2023年6月获FDA加速批准上市的Elevidys，主要用于治疗杜氏肌营养不良症（Duchenne Muscular Dystrophy,DMD），剂量为2×10¹⁴vg/kg】。

表1 获批上市的AAV基因治疗产品

（图片来源：Singh M et al., Gene Ther, 2023 ）

 

2.AAV载体在新型基因治疗中的应用

AAV属于细小病毒家族，病毒基因组长约4.7kb。目前已经鉴定出13种AAV血清型，这些血清型有100多种变体，来自不同的动物物种。根据其功能和血清学特征可分为6个支系(A-F)，以及两个克隆分离株(AAV4和AAV5)。AAV序列已在人类和灵长类动物的脾脏和肝脏中检测到高水平表达，同时也在包括大脑、结肠、肺、肾脏和骨髓等其他多种组织中检测到。用新的DNA序列替换Rep和Cap基因可以使野生型AAV成为新型基因治疗的有效载体，这对遗传性疾病治疗方法的发展具有巨大的推动作用。然而，使用AAV载体进行基因治疗也有潜在缺点，交叉反应性抗AAV抗体在人群中普遍存在，这可能导致产生免疫原性。此外，AAV转导多个组织的能力有可能造成转基因脱靶表达。在过去的10-15年里，研究者试图解决这些问题。实现这一目标的关键在于修饰AAV Cap基因，因为病毒衣壳对细胞/组织嗜性至关重要，同时也是与先天性和适应性免疫反应相互作用的接触点。用于产生新型AAV变体的技术主要包括肽库构建、DNA shuffling和易错PCR技术。

AAV载体已成为向患者提供新型体内基因治疗的首选载体，与其他病毒载体相比，AAV载体具有良好的安全性。由于AAV是复制缺陷型病毒，因此AAV基因治疗的水平传播可能性极低。虽然在给药后的人类精液样本和小鼠睾丸中检测到AAV载体，但在生殖系细胞中未检测到，并且已被证明不会通过生殖遗传从母体传给下一代。此外，在AAV基因治疗产品Glybera (Alipogene tiparvovec)的临床试验中，也未观察到生殖遗传的证据。被转导后，AAV载体在靶细胞核内保持游离状态，基因组整合率在0.1%至1%之间。在FDA细胞、组织和基因治疗咨询委员会最近一次会议上，就AAV的安全性潜在问题进行了讨论。讨论的一部分集中在数据上，这些数据显示接受AAV载体的实验小鼠已经显示出肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的迹象。截至目前，临床上的研究还没有出现与AAV载体相关的肿瘤案例。建议进行长期毒性研究以更仔细地评估AAV载体的致癌潜力。UniQure用于治疗血友病的AAV基因治疗产品AMT-061，因一名患者发生HCC而被临床暂停。经全面调查，得出的结论是该疗法不太可能导致患者发生HCC，因为患者存在多种与HCC相关的风险因素，包括乙型肝炎和25年的丙型肝炎病史，这两种疾病都会增加患肝癌的风险。

3.AAV基因疗法面临的挑战

要想有效地利用AAV基因疗法，仍需克服一些挑战：包括AAV基因疗法的免疫原性以及因AAV基因疗法给药而引起的毒性。关于毒性，研究表明AAV载体给药可导致脊神经节（Dorsal root ganglion，DRG）毒性，这是2021年FDA细胞、组织和基因疗法咨询委员会会议上讨论的话题之一。迄今为止，除了尤卡坦迷你猪和小鼠外，研究表明DRG毒性主要存在于非人灵长类动物（Non-human primates,NHPs）中。这些研究的组织病理学结果显示，AAV给药后导致了各种问题，包括颈椎、胸椎和腰椎DRG内的卫星现象、单核细胞浸润和初级感觉神经元（primary sensory neuron，PSN）细胞变性。除神经元细胞变性外，还观察到胸段、颈段、腰段脊髓上行纤维束和周围神经的轴突变性。目前还没有关于如何处理AAV基因治疗中DRG毒性问题的具体指南，但英国药品和保健产品监管局（Medicines and healthcare products regulatory agency，MHRA）Horizon Scanning Case Study指出，需要标准化AAV产品，以确定AAV产品的浓度(每毫升拷贝数或颗粒数)和颗粒空/满比率【编者补充：2022年11月MHRA发布了题为《Horizon Scanning Case Study: Developing standards for Adeno-associated virus genetherapies》的报告，通过Horizon Scanning这项工作，确定了AAV产品标准化的需求，这将增加患者对这些疗法的信心和这些创新药物的安全性】。此外，英国药典已经制定了一份关于AAV产品颗粒群特征的非强制性权威指导草案。据估计，30-60%的人群对几乎所有已确定的AAV血清型产生可检测到的抗体反应，这导致很大一部分潜在患者被排除在该治疗之外。抗AAV抗体在出生时即可检测到，随后在7至11个月内下降，这提示抗体能从母体垂直传播给后代。抗AAV免疫随后从儿童期发展到青春期。AAV基因治疗给药后，宿主免疫系统会对AAV载体产生免疫，因此再次给予相同的AAV基因治疗不太可能有效。因此，AAV基因治疗通常被认为是一次性治疗，而不是药物产品常见的多剂量治疗。如果发现所递送的转基因在靶细胞或靶组织中未长期表达，这可能对未来的健康产生潜在影响。如果初次AAV给药后检测到中和抗体，特别是如果使用与初始治疗相同的AAV血清型，这也会引发未来AAV基因疗法是否适合患者的问题。然而，令人欣慰是，AAV载体已被证明能够成功驱动长期的转基因表达，并在食蟹猴首次给药后15年仍可检测到治疗产品。但是最近，传统的AAV基因治疗单次给药策略受到挑战，研究人员正在考虑多次低剂量AAV基因治疗的可能性。最近一项研究表明，通过同时输注阻断靶向T细胞共刺激通路的抗体，可以实现AAV8的重复全身给药。因此，AAV基因治疗的重复给药可能成为未来常用的策略。

在AAV基因治疗临床试验中也观察到严重的不良事件，例如患者死亡。一项用于治疗DMD的AAV9基因疗法的Ib期临床试验在一名患者死亡后被暂停。一项独立研究中，4名X-连锁肌管肌病的患者接受AAV8基因疗法AT132后死亡并表现出肝损伤。其中3名患者接受了高剂量(3.5×10¹⁴vg/kg)的AT132,1名患者接受了低剂量(1.3×10¹⁴vg/kg)的AT132。然而应该注意的是，考虑到给药途径是静脉输注，低剂量的AT132仍然是AAV基因治疗中相对较高的剂量。其他高剂量(即2×10¹⁴ vg/kg或更高)的AAV基因疗法也观察到毒性，包括AveXis的Zolgensma (AAV9基因疗法)，辉瑞的PF-06939926 (AAV9基因疗法)和Solid Biosciences的SGT-001 (AAV9基因疗法)。在Solid Biosciences的临床试验中，观察到补体激活的问题，在辉瑞的临床试验中，出现溶血性尿毒症综合征的病例。总的来说，这些报告表明，剂量是使用AAV基因疗法的一个重要安全问题。

在评估AAV基因疗法的潜在安全性问题时，也必须考虑给药途径。身体的某些部位，包括眼睛、大脑、中枢神经系统、睾丸和妊娠子宫，都被认为是免疫豁免（immune-privileged）的部位，通过这些部位给药并不会产生强烈的免疫应答反应，除非全身系统性给药。与此相一致的是，FDA对Luxturna的临床审查表明，该临床试验中，仅观察到在针对视网膜下给药AAV2载体和RPE65转基因时发生轻微免疫反应，并未出现明显的免疫原性。EMA审评报告称，最严重的不良事件与Luxturna基因治疗无关，而是由已知的眼内手术并发症所致。由于Luxturna是眼部注射给药，因此可以推断，未观察到显著免疫原性的原因之一是由于眼睛属于免疫豁免部位。所选择的给药途径也会对新型AAV基因治疗的临床疗效产生显著影响。最近的一项系统性综述分析了为什么只有少数AAV基因疗法成功获得市场批准。据观察，与这些新型疗法的非临床研究相比，有14%的Ⅰ期或Ⅰ/Ⅱ临床试验在首次人体临床试验中使用了不同的给药途径。值得注意的是，在改变给药途径的临床试验中，没有一项达到了临床疗效。尽管AAV载体是迄今为止基因治疗取得巨大成功的范例之一，但目前正在开发可替代的基因递送方法。使用脂质纳米颗粒(Lipid nanoparticles，LNPs)代替AAV载体正受到广泛关注，因为LNPs有可能克服与AAV载体相关的问题，包括免疫原性、毒性和与AAV基因治疗相关的成本问题。除了LNPs外，工程蛋白质纳米颗粒、基于DNA的纳米载体和新型物理化学方法作为非病毒递送方法也正在研究中。正如大量计划中的和正在进行的临床试验所证明的那样，AAV载体在基因治疗中仍然发挥着关键作用。

4.新药研发转化为临床实践的核心——选择适当的动物模型进行关键非临床安全性研究

将AAV基因疗法的初步研究所生成的数据有效转化为临床试验的核心是选择适当的动物物种进行非临床研究。选择用于AAV基因治疗的非临床研究的动物模型需要考虑四个重要因素：1.在所选动物模型中确认候选临床产品的药理活性，2.确认动物对所选AAV血清型的易感性，3.确认AAV的细胞/组织嗜性，4.考虑所选非临床动物模型的生理学。

 

图1 动物模型选择流程图

（图片来源：Singh M et al., Gene Ther, 2023）

候选临床产品的药理学活性是决定非临床研究中使用适当动物模型的关键因素之一。非临床研究应采用最具药理学相关性的体内和体外模型。转基因在动物模型中所起的效果应与人体内观察到的相当，所使用的任何启动子系统在所选动物模型和人体内的功能也必须相当。AAV基因治疗具有药理学活性的非临床研究物种通常会表达人类靶向的受体/抗原表位/抗原。如果新型AAV基因治疗在所选动物物种中没有药理学活性，这可能导致发现研究和非临床研究中观察到的数据无法转化为临床试验中患者观察到的数据。动物模型中生成的数据之间的脱节在某些情况下可能会导致严重的发病率和死亡率。对于根据EMA指南被归类为GTMP的新型AAV基因疗法，一种动物模型足以进行关键非临床安全性研究。这与通常需要两种动物物种（啮齿类和非啮齿类）的小分子和生物制剂不同。

如果对选定的非临床动物进行AAV基因治疗不能完全预测患者的预期临床结果，则可能需要根据具体情况决定使用多个动物物种。如果没有药理学上相关的动物物种可用于AAV基因治疗的非临床研究，则可以考虑使用动物等效替代产品来生成体内数据，这些数据可用于证明在患者中启动临床试验的合理性。最近FDA批准的使用动物等效替代产品的体外疗法包括CD19-CAR T细胞疗法Yescarta和Tecartus。然而，需要指出的是，Yescarta和Tecartus这两款产品除了使用替代治疗产品进行体内试验外，还使用候选临床产品进行了各种体外试验。

在研究开始之前，确认AAV载体均可感染选定的非临床物种和人类，这是动物模型选择的另一个关键驱动因素。AAV载体必须能够规避宿主免疫系统的识别，并以类似的方式在非临床物种和人类中发挥作用。如果AAV载体无法感染选择的非临床物种，则无法有效地证明新型AAV基因治疗的安全性和有效性。AAV载体是否对非临床物种和人类中的相同细胞/等效细胞和/或组织具有嗜性，也是非临床研究中合适物种选择的关键考虑因素。已发表的文献已经证实了部分AAV载体的细胞/组织嗜性。建议在开始关键的非临床研究之前，在初始的发现研究和疗效研究阶段，可参考已发表的文献来设计体外和/或体内实验方案。啮齿类动物模型可用于AAV基因治疗的关键非临床安全性研究。然而，从小型动物到人类的数据转化具有挑战性，例如，啮齿动物的解剖结构和人相比存在显著差异，可能会妨碍某些给药程序，这时可能需要更大的动物模型，例如迷你猪、狗或NHPs。由于对DRG的担忧，在NHPs中进行AAV基因疗法研究可以得到监管机构的认可，因为NHPs会产生与人类在AAV给药后观察到的DRG毒性相似的反应。所选的非临床动物物种和人类之间的生理差异也必须考虑，以便从动物到人类的准确数据转化。如果动物模型中不存在从人类中发现的生理靶点，那么转化动物模型的数据会具有挑战性。

5.AAV基因治疗中常用的非临床动物模型

在本文中，作者对已发表的关于人类和常用动物物种AAV细胞和组织嗜性的文献进行了广泛的分析（表2）。AAV研究中最常用的动物模型是小鼠，其次是大鼠，这是意料之中的，因为小鼠和大鼠是开发小分子药物和生物制剂最常用的动物模型，这个趋势在GTMP的开发中也得到了延续。因为它们的繁殖时间快，易于操作和饲养，以及能够进行遗传技术操作和产生新的转基因品系。此外，现有的近交品系特征良好，包括免疫功能健全和免疫缺陷的品系，许多商业化试剂可用于啮齿动物细胞/组织。人源化小鼠模型最近也被用于AAV基因治疗的开发。当靶点不在所选动物中表达时，这些模型是有利的，但是使用这些动物可能会存在问题，因为它们是复杂的模型，按照GLP要求运行这些模型可能会有挑战性。此外，使用人源化模型可能会导致难以区分安全性和有效性问题。

历史上，非临床研究中最常用的大型动物模型是犬。特别是比格犬，经常被用于各种实验研究中。犬已被广泛用于AAV基因治疗的关键非临床研究中，包括Luxturna的非临床研究。近年来，随着小型猪的使用越来越多，伦理问题开始质疑将犬作为关键非临床研究的首选大型动物模型的既定理由。小型猪由于其生理和解剖结构与人类相似，现已成为标准毒理学模型之一。迄今为止，Göttingen小型猪是所有小型猪品系中基因组特征最为明显的。使用Göttingen小型猪的另一个优势是有历史数据，尽管这些数据主要来自小分子的研究。小型猪最近被用于各种AAV基因治疗研究中，包括靶向肝脏的AAV基因治疗、用于治疗亨廷顿病的AAV-miHTT基因疗法，以及FDA批准的AAV基因治疗Zolgensma的非临床研究。

NHPs是非临床研究中常用的物种，近年来其使用不断增加。由于NHPs是常用毒理学物种中与人类进化最接近的物种，因此它们已成为非临床研究的热门选择。然而，如前所述，候选临床产品在非临床物种中的药理活性是决定特定动物物种是否适合用于非临床研究的关键因素。此外，由于NHPs涉及的伦理问题，在非临床研究中使用NHPs之前，应该证明候选临床产品在其他常用毒理学物种中没有药理活性。此外，最近的COVID-19大流行给NHPs的供应商带来了相当大的压力，最终导致FDA发布建议，以放宽非临床研究中NHPs的供应限制。NHPs被视为AAV基因治疗发展的重要模型系统，并被用于Luxturna和Zolgensma的非临床研究。显然，NHPs在非临床研究中是一种重要的使用模式，并且在未来对它们的使用可能会继续增加。

表2 AA1-AAV12以及常见变体的组织嗜性

（图片来源：Singh M et al., Gene Ther, 2023）

  

表3 在非临床动物物种中通过常用给药途径分析AAV细胞/组织趋向性

（图片来源：Singh M et al., Gene Ther, 2023）

 

总结

AAV载体是体内基因治疗的首选载体。最近取得的进展，包括AAV基因疗法Luxturna、Zolgensma、Glybera、Roctavian、Hemgenix、Upstaza和Elevidys的上市许可，向科学家们展示了AAV基因疗法为疾病治疗带来的潜在可能性。为了充分利用AAV基因疗法治愈多种当前未满足的临床需求的潜力，必须为每种新型AAV基因疗法选择适当的非临床动物模型。本文讨论了AAV基因疗法当前的成功和存在的挑战。作者开发出示意图，使研究者能够在为AAV基因疗法选择适当的动物物种时充分考虑到每个问题，从而顺利完成研究工作。此外，作者还进行了广泛的文献回顾，并编制出详细表格，描述AAV血清型在人类和常用的毒理学物种中的组织嗜性。随着各领域学者对于AAV载体药物研究经验的不断积累，以及新的技术不断涌现，将为AAV载体药物的非临床研究提供更广阔的思路，和更精准高效的分析检测策略，这也将推动全球生物医药事业的蓬勃发展并造福全球病患。

 

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41434-023-00417-x