经过多年的曲折发展，基于腺相关病毒（AAV）的基因疗法在罕见病的治疗中已显示出巨大前景。而相较于传统小分子和大分子药物，目前的AAV质量分析技术尚未完全成熟，行业对AAV载体及其表征和质量控制的需求也正在迅速增加。2023年3月8-9日，ARM（the alliance for regenerative medicine，再生医学联盟）和USP（the united states pharmacopeial convention，美国药典委员会）共同举办了为期一天半的AAV分析表征研讨会，涵盖了与AAV质量相关的各种主题。本期将分为上中下三篇，上篇将为您详细介绍该研讨会中“空/完整衣壳表征”的主题内容。

 

AAV基本结构及基因递送原理

AAV病毒基因组大小约为4.7kb，由一个具有反向末端重复序列（inverted terminal repeat，ITR）的单链DNA和两个两端的开放阅读框(rep和cap)组成。基因组被包装在直径约26nm的衣壳中，由60个病毒蛋白以二十面体结构排列组成，一般情况衣壳VP1:VP2:VP3的比例约为1:1:10。不同AAV血清型的衣壳结构和VP比例略有不同。

 

 图1 AAV1衣壳结构

（图片来源：Optimizing AAV analytics to improve the safety, efficacy, and yield of AAV-based gene therapies: Takeaways from a scientific workshop，lead author：Lindsay Gasch）

基因治疗中，用于体内递送的重组AAV将Rep和Cap替换为治疗性基因表达盒。包装效率可能受DNA结构和大小的影响，但也可能还有其他尚未被充分了解的影响因素(例如，原料的等级)。在AAV载体的生产过程中，除了产生所需的全长目的基因的完整AAV载体（full）外，还伴有包装了部分目的基因的病毒颗粒（partial）、空衣壳病毒颗粒（empty），还有其他与工艺或产品相关的杂质，如宿主DNA片段、质粒DNA片段、没有任何编码序列的启动子/增强子序列等。上游制造工艺的合理设计可能有助于最大限度地产生携带全长目的基因的AAV载体。

 

 图2 AAV生产过程中所产生的病毒颗粒类型

（图片来源：Optimizing AAV analytics to improve the safety, efficacy, and yield of AAV-based gene therapies: Takeaways from a scientific workshop，lead author：Lindsay Gasch）

完整衣壳、空衣壳和部分衣壳

AAV分析行业中对于完整、空和部分衣壳的描述术语可能不尽相同。衣壳（capsids）可称为“颗粒（particles）”，部分衣壳（partial）可称为“中间体（intermediates）”或“轻（light）”衣壳，并且衣壳可优先根据其装载能力或其递送的“有效载荷（payload）”的完整性进行描述。

“缺陷干扰颗粒（defective-interfering particle，DIP）”一词是用来描述不包含全长目的基因衣壳的另一种方式。DIP可以是一个没有基因组物质的真正空衣壳，也可以是一个包含片段化或部分基因组、质粒DNA片段、辅助基因或宿主DNA片段的衣壳。在某些情况下，DIP可能是正确包装的完整衣壳，这可能会给下游纯化带来挑战。

该研讨会的参会者普遍认同需要标准化术语，但FDA向开发人员保证，他们对所有类型的术语都是持开放态度。事实上，有效载荷是FDA主要关注的问题，但一致性评估可能相当具有挑战性。因此，在本文中将使用“完整/部分/空衣壳”这一术语。

与完整/部分/空衣壳相关的监管期望

在监管文件中，关于空衣壳、部分衣壳和完整衣壳的报告情况不一致。根据FDA的规定，制药公司偶尔只报告空衣壳百分比，但他们的方法可能不足以完全支持该表征(例如，仅使用光密度法 vs. AUC)。在这些情况下，FDA可能会建议进行额外的表征研究。在某些情况下，空壳率可能成为放行标准，但空衣壳、部分衣壳和完整衣壳都可能作为一组完整表征指标的一部分进行检测。FDA指出，当生产变更后需要进行可比性研究时，强有力的一组表征指标可能会有所帮助。由于自互补AAV（self-complementary AAV, scAAV，scAAV）载体可以同时包装单链和双链DNA，因此自互补的部分衣壳可能比单链AAV载体更为普遍，这可能是开发者需要考虑的一个重要因素。

展望未来，开发人员指出，为完整/空/部分衣壳建立规范的监管指南可以从它们的标准定义着手，并且应该基于AAV基因治疗的特定方面(而不是细胞治疗等其他治疗方式)。此外，监管期望应基于已证实的分析方法(有确定的参考标准，也可以借助于预先确定的定义)，并与可行的生产方法兼容。验收标准还应考虑基因治疗产品、给药途径和患者剂量的固有差异。

为了设定衣壳数量的最佳参考标准，开发人员和监管机构一致认为，需要更好地表征空衣壳、部分衣壳和完整衣壳。值得注意的是，在制定参考标准时，USP会从多个合作实验室进行严格的评估和数据审查。按照这些思路，USP鼓励开发人员继续开展表征工作，并权衡最理想的标准类型(例如，完整、部分或空衣壳的标准 vs. 每种衣壳的标准)。

 

 图3 USP充分支持AAV基因治疗开发

（图片来源：Optimizing AAV analytics to improve the safety, efficacy, and yield of AAV-based gene therapies: Takeaways from a scientific workshop，lead author：Lindsay Gasch）

空衣壳和部分衣壳重要的原因

空衣壳或部分衣壳可能会引发不必要的免疫反应，降低转导效率，最终影响基因治疗产品的功效。人类暴露于自然界中存在的野生型AAV，因此人体预先存在针对AAV衣壳的抗体和T细胞。AAV载体给药后，可立即触发局部或全身先天免疫反应。在随后的几天里，先天免疫反应和适应性免疫反应都会出现。特别是在AAV剂量较高(>1×10¹⁴vg/kg)的情况下，先天免疫反应和体液适应性免疫反应之间的协同作用可导致补体激活，从而诱发严重的毒性。FDA关注空衣壳的一个重要原因是对毒性的担忧，包括肝脏中T细胞对转导细胞的反应和血栓性微血管病，这可能与总衣壳负荷(即空衣壳、部分衣壳和完整衣壳)有关。

 

 图4 对AAV的免疫反应以及空衣壳在人体中引发的免疫反应

（图片来源：Optimizing AAV analytics to improve the safety, efficacy, and yield of AAV-based gene therapies: Takeaways from a scientific workshop，lead author：Lindsay Gasch）

载体总载量会随着产品剂量的增加而增加，空衣壳和部分衣壳对特定产品的免疫原性或毒性潜力的影响程度也会增加。衣壳效应也可能因其血清型和生物分布以及疾病状态、组织靶点、给药途径以及患者的年龄和免疫状态而异。再加上缺乏标准化的术语，这些变量的差异使得很难理解空衣壳或部分衣壳如何促进免疫反应。与过去观点相反，中枢神经系统（central nervous system，CNS）并不是一个“免疫豁免”的环境，特别是在涉及AAV时。即使是鞘内注射或直接注射进大脑时，大量的AAV也会迁移至全身。同样，在CNS局部注射AAV后，在血清和脑脊液（cerebro-spinal fluid，CSF）中可发现中和抗体。目前，还没有标准化的方案来调节对这些产品的免疫反应。研究人员正在对不同的免疫抑制剂(如泼尼松、西罗莫司、他克莫司、单克隆抗体)进行试验，其结果各不相同。较低剂量的药物制剂或更好的衣壳设计(较低的肝亲和性)可能有助于减轻其免疫原性潜力。

研究表明，较高比例的空衣壳会导致较低的体外效力和小鼠肝脏中的转导减少，这可能是由于空衣壳与完整衣壳竞争细胞结合位点和细胞内化所致。重要的是，空衣壳对非人灵长类动物（non-human primates,NHP）或人类的效力产生的影响尚不清楚，不应过度解读从体外或小鼠模型中获得的信息。对于高剂量的AAV药物产品，专家组成员推测在体内可能会达到饱和点，此时空衣壳可能会在与细胞表面表位结合方面胜过完整衣壳。如果情况属实，则需要确定这种竞争影响药物产品功效所需的剂量阈值。

衣壳异质性

衣壳异质性也可能影响AAV基因治疗产品的疗效和免疫原性。异质性可能源于AAV衣壳蛋白的VP1:VP2:VP3亚基比例、翻译后修饰或其三维定向的差异，以及聚集体的形成。

AAV衣壳蛋白的翻译后修饰（post-translational modification，PTM）可能受到表达系统、生物反应器条件、下游工艺以及在处理或储存期间暴露于不利条件的影响。PTMs如氧化、脱酰胺、糖基化、乙酰化和磷酸化等很常见。此外，还观察到SUMO化修饰（SUMOylation）和泛素化修饰。乙酰化、磷酸化和糖基化是发生在细胞共译或翻译后的酶促PTMs，不会在药物产物合成后自发出现。而氧化和脱酰胺是在上游加工、下游加工、配方和储存过程中的任何时刻都可能发生的非酶修饰。有趣的是，有报道称减少脱酰胺可以改善载体功能。一位研究人员发现，与完整衣壳相比，空衣壳具有更高水平的VP1脱酰胺，并补充说VP1在核内体运输中起着重要作用。然而，FDA警告说，这一发现可能不适用于所有空衣壳，因为PTMs往往具有很强的产品、血清型，甚至工艺特异性。

有几种方法可以检测衣壳蛋白的PTMs。完整水平的反相HPLC-MS（高效液相色谱-质谱）分析可用于筛选主要的病毒蛋白种类，并可用于评估批次间的一致性。LC-MS肽图分析是一种用于鉴定和定量PTM的高分辨率表征方法，但通量相对较低并且会产生复杂的数据集。因此，从LC-MS肽图中收集的数据可用于开发更高通量的方法，以筛选和量化任何对载体产品质量至关重要的PTM。在确定PTM是否是真正的关键质量属性（critical quality attributes，CQA）时，必须单独评估每个PTM的影响因子和不确定性。

强制降解研究可用于帮助理解PTM发生的原因以及它们如何影响工艺或产品。诱导氧化应激可以监测其对产物损失和空/满比的影响，而将AAV暴露在酸性条件或高温下可以增加对加速聚集和片段化的理解。高温应激可以提供在预期储存条件下随时间推移的潜在降解的有用信息。

综上所述，更好地了解PTM可以为改善AAV的生产、转导、稳定性和安全性铺平道路。

AAV衣壳的表征方法

AAV衣壳表征的考虑因素包括颗粒总滴度(例如，由AAV衣壳产生的所有蛋白质含量)、空衣壳、部分衣壳和完整衣壳含量的评估、部分衣壳和完整衣壳的基因组DNA含量和鉴定、AAV血清型鉴定或AAV衣壳亚基的PTM。下图罗列了目前用于表征衣壳蛋白或其基因组含量的方法和技术。

 

 图5 AAV衣壳的表征方法

（图片来源：Optimizing AAV analytics to improve the safety, efficacy, and yield of AAV-based gene therapies: Takeaways from a scientific workshop，lead author：Lindsay Gasch）

 

为了支持AAV衣壳表征，USP获得了多种AAV血清型(2、5、6、8和9)的完整衣壳、空衣壳以及50%满/50%空的样品。通过内部和外部合作，他们研究了各种定量AAV5和AAV8衣壳比例的方法，包括dPCR和ELISA、SEC-MALS、CD-MS、CE-Immunoassay和cIEF。通过这些方法确定的空/满比率通常是一致的，特别是对于AAV5。计划的USP工作包括将AUC分析作为表征方法，未来的工作可能包括对含有部分完整AAV衣壳样品进行表征。

二代测序(next-generation sequencing，NGS)被认为是表征衣壳基因组含量的一种可靠方法。虽然传统的凝胶电泳可以提供关于病毒DNA大小的重要信息，但并不能提供序列一致性（sequence identity）。短读长测序技术（short-read NGS）可对基因组DNA进行片段化处理，提供了一种高通量、准确的量化和确认序列的方法。短读长测序可提供许多短片段的有效载荷或污染物的信息，可以深入了解污染物DNA的来源(例如质粒骨架、rep、cap)，并且是一种可同时检查多个载体的有效方法。长读长测序技术（long-read NGS）可以直接进行DNA测序，并提供个体基因组序列配置的结构信息。长读长测序揭示，被认为“空”的衣壳可能含有小的ITR序列片段，而短读长测序中被认为“有效载荷匹配”的读段实际上代表了嵌合基因组，不会产生目的治疗性蛋白。这些小的ITR序列或嵌合基因组是否会影响治疗结果仍有待确定。

总体而言，短读和长读长测序代表了对完整和部分衣壳基因组含量进行进一步表征的互补方法。值得注意的是，FDA正在不断完善其生物信息学专业知识，以更好地了解NGS数据如何适用于空/部分/完整衣壳表征。

优化下游纯化方法，以最大限度地减少空衣壳

由于空衣壳对AAV基因治疗的疗效和安全性的影响尚不清楚，因此开发人员应该寻求合适途径来减少空衣壳。空衣壳和完整衣壳的表面特性是相似的，这使得共洗脱很常见，因此空衣壳的去除对下游纯化而言是一个重大的挑战。研究人员推测，引起电荷变化(例如磷酸化)或衣壳蛋白定向变化的PTMs可能导致异质性物质在层析步骤中与完整衣壳共洗脱。

在AAV下游工艺中，亲和层析可以用作第一个纯化步骤，用于去除大部分宿主细胞杂质。这一步之后通常是阴离子交换层析（anion exchange chromatography，AEX），它有助于根据DNA含量引起的电荷差异将空衣壳和完整衣壳分离出“峰”。AEX还有助于去除残留的宿主细胞和化学杂质以及AAV聚集体。对于将AEX作为最后纯化步骤的开发人员来说，确定AEX树脂的批间差异至关重要，因为树脂的差异会影响分离能力。所使用的AAV血清型和缓冲液也会影响AEX分离空衣壳和完整衣壳的效果。

事实上，AEX后可能仍然存在异质性衣壳。因此，ZUC (zonal ultracentrifugation) 等技术可以通过密度差进一步分离空衣壳和完整衣壳。与层析法相比，ZUC放大更具挑战性。优化的ZUC工艺可能不会显著影响产量。

使用正交法进行纯化，持续、逐步地去除空衣壳和其他杂质，可将药物中的不良成分降至较低或检测不到的水平。这些方法应该普遍适用于多种AAV血清型，但由于空衣壳和完整衣壳的电荷和密度特征在不同血清型中可能存在差异，因此需要针对每种血清型进行优化。最佳纯化方法及其测序仍有待确定。