AAV分析表征

2023年3月8-9日，ARM（the alliance for regenerative medicine，再生医学联盟）和USP（the united states pharmacopeial convention，美国药典委员会）共同举办了为期一天半的AAV分析表征研讨会，涵盖了与AAV质量相关的各种主题。本期将分为上中下三篇，上篇和中篇为大家详细介绍了该研讨会中“空/完整衣壳表征”和“效力测试（potency assays）”主题内容，下篇将为您介绍“载体基因组滴度测定和剂量”主题内容。

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优化AAV分析方法以提高AAV基因疗法的安全性、有效性和产量（上）

优化AAV分析方法以提高AAV基因疗法的安全性、有效性和产量（中）

载体基因组滴度

载体基因组滴度(vg/mL)通常用于确定AAV基因治疗产品的临床剂量。载体基因组滴度表示每mL产品中含有目的基因组的纯化后载体颗粒的物理浓度。准确的AAV基因组滴度是临床前和临床研究剂量确定的基础。

载体基因组滴度测定方法

目前常用的基因组滴度检测方法为qPCR（quantitative polymerase chain reaction）和ddPCR（digital droplet polymerase chain reaction），这些定量技术都有其独特的工作流程和优缺点，因此需要根据具体项目（program-specific）或具体阶段（phase-specific）选择合适的测定方法。

CDMO领域的一位高管分享了一个从qPCR到ddPCR策略转变的例子，以配合客户的项目计划。在可比性研究中，qPCR和ddPCR两种方法得出的AAV2和AAV8载体基因组滴度结果相当。此外，在经多次重复分析后，发现ddPCR具有良好的中间精密度(＜6% CV)。另一位演讲者也分享了一个例子，qPCR方法检测得到的的载体基因组滴度始终比ddPCR检测的结果高约2倍。

图1 不同检测方法的流程图

（图片来源：Optimizing AAV analytics to improve the safety, efficacy, and yield of AAV-based gene therapies: Takeaways from a scientific workshop，lead author：Lindsay Gasch）

图2 qPCR和ddPCR优缺点比较

（图片来源：Optimizing AAV analytics to improve the safety, efficacy, and yield of AAV-based gene therapies: Takeaways from a scientific workshop，lead author：Lindsay Gasch）

从载体基因组滴度到量化载体基因组完整性

单重 PCR（simplex PCR）方法，如qPCR和ddPCR，提供的基因组完整性信息有限。由于PCR本身会扩增小片段，qPCR或ddPCR测定的滴度可能会高于全长基因组。这会存在一定的误差，因为全长基因组代表了目的基因的有效荷载。

图3 单重PCR方法过高评估全长基因组

（图片来源：Optimizing AAV analytics to improve the safety, efficacy, and yield of AAV-based gene therapies: Takeaways from a scientific workshop，lead author：Lindsay Gasch）

一位开发人员提出，载体基因组完整性可能成为重要的CQA（critical quality attribute），但他指出的这一点仍有争议。多重dPCR检测，每个反应有更多的靶点，可以更仔细地观察基因组完整性。在载体基因组的开始和结束各有一个靶点的双重检测是多重dPCR最简单的例子。然而，双重检测仍有可能检测到单个片段，这就需要充分了解样本中的靶点分布。三重和四重PCR检测法虽然在开发、鉴定和验证方面越来越复杂，但可以更详细地了解目标序列的完整性。

图4 通过四重dPCR了解载体基因组完整性

（图片来源：Optimizing AAV analytics to improve the safety, efficacy, and yield of AAV-based gene therapies: Takeaways from a scientific workshop，lead author：Lindsay Gasch）

事实上，这位开发人员介绍了一种四重PCR检测方法，该方法目前已被开发用于定量AAV载体基因组，还可以添加其他靶点。该方法在基因组全长百分比范围内具有良好的重复性、精密度和线性。他建议，基因组完整性定量的结果可用于指导工艺开发，甚至可以确定上游或下游工艺中富集特定片段群的不同步骤。

综上所述，多重dPCR检测能够更好地表征产物，并且有助于工艺优化，从而提高衣壳内全长病毒基因组的产量。多重检测通常可降低成本，因为联合检测可避免对每个潜在靶点进行单独检测。对全长包装基因组进行富集可提高效力，从而降低给药剂量，提高患者安全性。目前需要更详细的研究来确定基因组完整性和效力之间的真正相关性。

利用SEC-MALS技术测定颗粒滴度

一名开发人员在利用ddPCR技术验证载体基因组滴度时观察到较大的变异性。这促使他的公司将SEC-MALS技术作为一种稳健、灵敏和自动化的基因组滴度检测方法进行研究。SEC-MALS技术将尺寸排阻色谱（size exclusion chromatography,SEC）与多角度光散射（multi-angle light scattering,MALS）以及在线浓度检测器相结合，可以检测多种AAV特征(例如聚集度、杂质、空满衣壳比和DNA含量)，也是一种基因组滴度检测方法。

SEC-MALS并不是一种可以完全取代ddPCR的工具，而是可以帮助更快地鉴定批次，并为工艺开发人员提供有关生产运行情况的更好反馈。

图5 ddPCR和SEC-MALS的优缺点比较

（图片来源：Optimizing AAV analytics to improve the safety, efficacy, and yield of AAV-based gene therapies: Takeaways from a scientific workshop，lead author：Lindsay Gasch）

载体基因组滴度测定的监管考虑因素 

FDA对确定AAV基因组滴度所选择的具体检测方法没有限制，但在启动临床研究之前，应对该检测法进行验证。这需要证明该方法的线性、准确性、范围、精密度、灵敏度和专属性。早期研究阶段的一般监管期望包括：(1)加标回收率约为预期值的80%-120%；(2)中间精密度CV≤15%；(3)使用无关AAV载体作为对照(而不仅仅是缓冲液)。此外，FDA建议开发人员花大量时间了解AAV基因组滴度测定的变异性原因(例如试剂、人员、设备)。

 

图6 pre-IND会议上关于载体基因组滴度测定的监管建议

（图片来源：Optimizing AAV analytics to improve the safety, efficacy, and yield of AAV-based gene therapies: Takeaways from a scientific workshop，lead author：Lindsay Gasch）

与效力测试的开发一样，AAV基因组滴度检测法的开发也遵循生命周期方法。临床开发和CMC开发应该基本同步。如果开发商期望从临床Ⅱ期试验中获得疗效数据(例如，与加速产品开发计划相结合)，那么对CMC的预期应与临床Ⅱ期试验一样被视为关键研究。这种情况下，在启动临床Ⅱ期试验之前，需要对含量测定试验进行验证。

对于进入州际贸易的任何AAV基因治疗产品，预期的给药剂量将基于标准化滴度（nominal titer），从而降低剂量计算错误的可能性。在临床Ⅰ期阶段，给药剂量通常通过测定每个特定批次的载体基因组滴度(即“测量滴度”)来确定。这可能没有考虑到含量测定试验的内在变异性，而且需要医师或药剂师根据批次特异性滴度和患者体重(适用时)准备给药剂量。采用“标准化滴度”时，AAV产品药剂瓶上标有目标载体基因组浓度，这意味着在每个放行批次的药剂瓶标签上都印有相同的含量。药剂师或医师将根据目标滴度和患者体重(如适用)准备给药剂量，可能使用剂量工作表或给药剂量表。BLA文件中提供的标准化滴度必须有临床数据支持。因此，在临床Ⅰ期和BLA提交之间，应使用标准化剂量获得安全性和有效性数据。这需要临床前工作人员、临床医师、生产操作人员和质量控制团队成员之间进行大量沟通。

 

 

图7 使用测量滴度与标准化滴度进行剂量计算的示例

（图片来源：Optimizing AAV analytics to improve the safety, efficacy, and yield of AAV-based gene therapies: Takeaways from a scientific workshop，lead author：Lindsay Gasch）

通过标准化滴度方法确定适当剂量需要非常严格的产品含量验收标准(即X vg/mL + Y% 或- Z%)。这些验收标准需要根据最终临床剂量中可接受的变化幅度来建立和证明，最终临床剂量的变化幅度可以通过观察不良事件之前的剂量上限和在临床前试验中观察生物活性所需的基础剂量来确定。最终，实现严格的验收标准需要稳健的生产和精确的含量测定，这可以降低批次放行失败的几率。

 

 

图8 标准化滴度测定的验收标准

（图片来源：Optimizing AAV analytics to improve the safety, efficacy, and yield of AAV-based gene therapies: Takeaways from a scientific workshop，lead author：Lindsay Gasch）

值得注意的是，总衣壳滴度测定通常不适用于含量测定。唯一的例外的情况是，各批次的空衣壳百分比可以忽略不计（＜1-2%）且批次间非常一致。然而，总衣壳滴度测定可向患者提供抗原荷载量信息，FDA认为这一点很重要。衣壳滴度的直接测定(例如ELISA)可能比根据AUC数据进行反向计算更合适和准确，但任何符合目的的检测方法都会被考虑。除了载体基因组滴度和衣壳滴度检测之外，FDA还建议直接进行药物产品的完整/空衣壳比值检测(例如IEX、AUC、EM)。这为下游工艺去除空衣壳杂质的稳健性提供了信息，并使开发人员能够跟踪批次间的一致性。

 

AAV基因治疗分析的平台方法 

基因治疗产品的研发成本可能与其他生物制剂一样高（或更高），但基因治疗是单次给药，并非长期给药。因此，开发人员必须通过单次给药来收回研发成本，从而导致患者或医疗系统承担高昂的费用。目前，该行业正在努力寻找生产基因治疗产品的方法，使基因治疗产品的成本实现可报销，同时提高患者可及性，而且在经济上具有足够的吸引力，使公司继续投资该领域。

AAV基因治疗产品研发之路往往是迭代而非线性式的，业内人士一致认为，行业的增长和需求需要向工业化和可操作化迈进。利用以往产品研发中获得的经验和分析作为候选新药的平台方法，可以帮助公司提高产品供应水平(优先考虑)，同时通过提高产量(通过工艺改进或自动化)和减少折旧(通过选择生产设备)最大限度地降低成本。

一名开发人员分享了他的公司如何从开创性/定制思维转向AAV产品开发的平台方法。这种平台方法的理念来自更成熟的行业，最终形成了一个模块化系统，在不同产品、生产基地和生产规模之间保持一致。值得一提的是，这些模块的开发可以根据不同产品的固有差异进行微调。该平台不仅包括制造业务，还包括信息技术和物流等配套基础设施。这位开发人员使用的是基于昆虫细胞、杆状病毒的AAV开发平台，已将CMC开发时间缩短至18个月，从而使其进入临床的时间与使用HEK-293平台的大型CMO公司的时间一样快。通过多次迭代，他们已将商品成本降低了100倍。这位开发人员指出，产品成本的降低是昆虫生产系统(如杆状病毒)相对于哺乳动物生产系统(如HEK-293)的主要优势，并补充道在临床Ⅲ期试验中，市场需求高的疗法往往使用的是昆虫细胞生产系统。

 

 

图9 AAV发展的潜在世代平台方法

（图片来源：Optimizing AAV analytics to improve the safety, efficacy, and yield of AAV-based gene therapies: Takeaways from a scientific workshop，lead author：Lindsay Gasch）

总结

本次研讨会汇集了AAV基因治疗行业的专家，更好地协调了该领域的分析进展和监管要求。总体而言，演讲者和参会者一致认为，像这样的研讨会对整个行业和所有关键利益相关者都是有益的，它提供了一个能从过去的经验中学习到有效信息的合作和分享的机会。希望该行业能够在AAV基因疗法的前景及其固有风险之间取得适当的平衡，同时满足日益增长的患者需求，并对开发商和制造商保持吸引力。

研讨会提出了几个明确的需求、期望和机会。关于完整衣壳/部分衣壳/空衣壳，需要标准术语、适当的参考标准、制定有意义规范的监管指南，并进一步了解不同类型衣壳如何引起免疫应答以及影响毒性和疗效。在效力和载体基因组滴度检测方面，人们认识到这类检测方法在药品的整个生命周期中不断发展，需要时间和资金来进行开发，并且应在开发过程的早期就致力于实现这些目标，以防止在临床试验阶段出现瓶颈。提交给FDA的任何分析方法都必须有数据支持，同时建议尽早并经常与监管机构进行互动，提交给监管机构的所有方案都应清晰、简洁，并提出相关问题，从而获得可采取行动的有效反馈。