近几十年来，人类在基因治疗领域取得了一系列里程碑突破，使其为重大难治性疾病提供了新的治疗方案，市场前景良好。腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)已成为基因治疗的首选载体，也被公认为目前最有前景的递送载体。虽然基因治疗在概念上极具吸引力，但其所引起的不良甚至致命的医源性并发症降低了临床成功的最初热情。因此，来自美国辉瑞公司药物安全研发部门的Basel T.Assaf和Laurence O. Whiteley在《Toxicologic Pathology》上发表了题为“Considerations for Preclinical Safety Assessment of Adeno-Associated Virus Gene Therapy Products”的综述，与小分子药物和其他大分子生物制剂相比，基于AAV的研究性基因疗法的特性可能会引起独特的安全性问题，如转基因的异位或不受调节表达、长期持续存在和脱靶分布等。本文详细论述了AAV基因疗法在人体给药前设计全面的临床前安全方案时应考虑的因素。

临床前研究设计的一般考虑

根据21 CFR 312.23 (a)(8)-药理学和毒理学信息中IND申请规定，任何临床前项目的最终目标是生成“…关于药理学和毒理学研究的充分信息…在此基础上，申办者得出结论，实施拟议的临床研究是合理安全的。所需的动物实验和其他实验的种类、持续时间和范围因拟议临床研究的持续时间和性质而异”。

与其他疗法类似，基因治疗临床前研究项目的目标是预测人体有效剂量范围，建立安全起始剂量，并确定与剂量相关的毒性特征。由于载体衣壳会引起机体中和抗体反应，系统性基因治疗只能给药一次，因此与其他疗法的关键区别在于，临床起始剂量应具有提供临床益处的潜力。临床前安全性评估的设计应使用预定的最终试验品构建体和给药途径（route of administration，ROA）来模拟临床场景。由于最终试验品构建体表达了属于临床前动物物种的外源转基因蛋白产物，因此可能会诱导免疫原性反应。这种免疫反应很可能仅限于动物中，不会影响预期的人类患者群体。为了在动物中适当地进行基因治疗生物学和安全性研究，应考虑使用免疫抑制动物或对动物自身无免疫原性的替代同源转基因。对于具有明显进行性和退行性变化的遗传性疾病，早期干预能为基因治疗的成功带来更多可能性。这通常涉及对儿科人群进行治疗，因此临床前计划应考虑使用与预期临床人群年龄匹配的动物。

研究药物持续作用时间是另一个重要的考虑因素，因为基因治疗通常只进行单次给药，旨在评估首次人体试验毒性特征的研究可能是支持药物产品注册的唯一研究。在研究方案设计阶段，应评估病毒载体与动物试验系统的急性效应、与转基因初始峰值表达有关的变化、以及与转基因持久表达相关的效应。这些将用于评估载体在组织内的生物分布、持久性以及转基因表达的起始和稳定性。持续时间、尸检时间点数量和数据终点指标都是与监管机构讨论的关键点。这些终点指标可能会根据之前使用的载体衣壳、表达构建体和转基因生物学的研究经验而有所不同。研究可能需要两个尸检时间点，例如在第4周和第13周，以便评估载体DNA和转基因表达的持久性，以及与峰值(第4周)起始和转基因稳态表达暴露(第13周)的相关效应。研究者通常可以通过临床病理学终点和活体的临床评估（其中包括心血管系统、神经系统和呼吸系统等安全性药理学评估）来评估转基因与动物试验系统的早期相互作用。

基因治疗临床前研究的一个关键组成部分是评估载体DNA的生物分布和转基因在组织中的表达(mRNA或蛋白质)。通常，通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)、原位杂交(in situ hybridization,ISH)和免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)等方法来检测血液、主要器官以及性腺中载体DNA和转基因表达是否存在及其持久性。临床前试验中还可能包括评估载体脱落(或未脱落)进入生物体液(精液、尿液、粪便、唾液和眼泪)的情况。EMA指南要求临床前研究评估载体脱落情况，而FDA指南则没有(当使用AAV等复制缺陷型载体时)。不过，FDA和EMA都要求在临床开发项目中对生物体液中的脱落情况进行评估。评估毒性结果与载体DNA或转基因表达之间的关系非常重要。例如，虽然载体DNA在性腺内的持续存在可能会引起对载体DNA生殖细胞系传播的担忧，但除了精母细胞和卵子外，睾丸和卵巢中还有许多类型的细胞可以被病毒载体转导。在这种情况下，对携带载体DNA的细胞类型进行适当筛选可能会减少为评估生殖系传播而进行育种研究的需要。除了生物分布评估之外，临床前毒理学研究项目还包括标准临床病理学、活体评估、安全药理学、眼科、器官重量和组织病理学。

动物物种选择

在任何疗法的疗效性和安全性评估中，生理学和解剖学的可比性是动物物种选择的首要考虑因素。然而，附加标准可能会显著影响基因治疗临床前安全性评估中动物种类的选择。FDA和EMA指南文件均表明，临床前毒理学项目不需要两种物种，非啮齿类动物物种也不是必须选择。因此，一种相关啮齿类动物物种就足够了。此外，将安全性终点纳入疾病模型研究可能替代正常动物的毒理学研究，并且可能对了解基因治疗在疾病环境中的安全性具有重要意义。如果需要两种物种的毒理学计划，在疾病模型研究中纳入安全性终点可以替代所使用的一种物种。物种的选择和疾病模型的使用应具有科学依据，并得到相应监管机构的同意。

选择动物物种时需要考虑的其他因素:

1. 如果要使用给药装置，那么临床前动物物种需要适应该装置的使用，并模拟该装置在人体中与之相互作用的解剖结构。

2. 特定载体的组织趋向性在动物和人之间的转化可能是未知的。当前并未规定应该使用什么物种，但是如果不同物种的治疗靶器官转导效率或脱靶组织分布存在显著差异，则应考虑哪种动物物种对人类最具有代表性。

3. 如果治疗性转基因产物在动物物种中具有免疫原性，并且导致转基因的药理学活性或毒性被中和，那么应考虑使用免疫抑制或对物种特异性转基因。

4. 转基因应在用于安全性评价的临床前动物物种中具有药理活性。如果不存在活性，那么应使用对动物等效的转基因作为替代。

5. 原本存在的AAV中和抗体会阻止载体在组织间的转导。因此在进行研究之前，通常会对非啮齿动物进行原本存在的抗体的筛查。研究人员需要考虑大型动物物种中原本存在的中和抗体的流行率，因为高流行率可能会导致难以选择足够数量的阴性对照动物纳入研究。中和抗体的流行率在不同的大型动物、大型动物供应商和非人灵长类动物(non human primates，NHPs)之间有所不同。

如果要在疾病模型中评估安全性，则应对该模型进行充分表征，以区分病变发生是与遗传背景相关还是由试验物品诱发。疾病模型构建可在非常专业化的实验室中进行，也可在非GLP（good laboratory practices，GLP）实验室中进行。只要研究设计合理、记录保存得当，这些研究还是可以转变为GLP-like的研究，前提是：要注重前瞻性充分规划、完成报告并详细记录程序、招募独立的研究监督员，以及使用合同研究组织（contract research organization，CRO）以符合GLP的方式进行尸检、组织病理学评估和临床病理学评估。

在临床前安全性评估策略的设计中，应考虑物种间在毒性易感性方面的差异。一份关于物种依赖性差异的报告表明，在小鼠、猫和羊(疾病模型)中直接颅内注射能编码物种特异性己糖氨酸酶的AAVrh8载体后，并未产生任何毒性迹象。然而，当在NHPs中测试相同表达载体时，尽管没有任何体液和细胞介导免疫反应的证据，但动物出现了与神经元中嗜酸性粒细胞聚集形式的蛋白质过度表达相关的神经症状。

同样，在幼猪和NHPs中注射相同AAVhu68载体后，结果显示在这两个物种的肝脏中发生了显著的病毒基因组数量表达差异，表明载体转导效率存在物种特异性效应，这与不同的毒理学反应有关。当在C57BL/6J小鼠和BALB/cJ小鼠中注射相同的AAV-PHP.B载体时，结果显示该载体在C57BL/6J小鼠中表现出独特的神经嗜性增强，但在BALB/cJ小鼠或NHPs中却没有，此项研究突出了小鼠品系特异性和种属特异性差异。

DNA整合

与逆转录病毒载体（retroviruses）不同，AAV载体不需要整合进宿主细胞基因组中产生转基因蛋白产物。然而，AAV载体确实会以非常低的频率整合进宿主细胞基因组中。虽然AAV被认为是一种非整合载体，但数据显示，在某些容易产生肿瘤的动物模型中，AAV的整合可能会引起遗传毒性作用，从而导致肿瘤性转化。尽管如此，重组AAV载体的致癌潜力仍然存在争议，并且目前的小鼠实验数据在非啮齿动物物种和人类中的可转化性还有待确定。评估DNA整合的必要性在同一/不同地区的监管机构之间可能有所不同。因此，这个话题应成为与监管机构的讨论点，并应考虑从毒理学研究中收集适当的样本，以便在监管机构的要求下，随着项目的进行或在临床前研究中出现值得关注的观察结果时，对DNA整合情况进行评估。主动收集组织可以避免进行重复研究，也能最大限度地减少动物使用。

生殖毒理学评估

除了在支持血友病临床试验的项目中评估精液中AAV载体的清除情况外，基因治疗在生殖毒理学方面经验较少。然而，评估潜在的生殖毒理学可能是必要的，因为更多的AAV治疗针对的是育龄女性。此外，未来可能需要进行胚胎-胎儿发育研究，以探究AAV穿过胎盘屏障的能力、胎盘转移的阶段依赖性易感性以及介导这种作用的潜在血清型差异。

免疫反应的临床前评估

AAV载体来源于人类和动物中广泛存在的天然病毒。如上所述，这就需要对用于研究的动物进行预筛选，选择血清阴性的动物从而产生可阻止组织转导的中和抗体。

载体给药后，其衣壳蛋白会引起体液免疫反应。由此产生的抗体将阻止载体的再次给药，但目前尚未发现它们与毒性有关。体液免疫反应也可能发生在转基因蛋白中，它可以中和转基因的药理学作用或导致抗原-抗体介导的不良反应。细胞介导的免疫反应可以发生在转基因蛋白和衣壳蛋白上，导致T细胞介导的转导细胞被破坏。这种破坏可能仅与疗效相关，因为它会导致表达预期转基因蛋白产物的转导细胞被清除。然而，如果靶细胞位于具有储备或再生能力极低的重要器官内，则可能产生不良毒性。与其他生物学模式类似，临床前研究并不能一致地预测人体免疫反应的类型或程度。值得注意的是，在血友病临床试验中，观察到某些个体对AAV载体衣壳产生T细胞免疫反应，而在啮齿类动物或NHPs的临床前安全性研究中并未观察到。载体DNA、转基因(mRNA和蛋白质)、载体衣壳以及宿主遗传学之间存在着复杂的、尚不清楚的相互作用，影响着免疫反应的发展。

原本存在的抗AAV中和抗体的影响

原本存在的中和抗体，在AAV基因治疗的最终疗效中发挥重要作用。它不仅会影响产品的安全性，还会显著影响其有效性、合适的临床前动物种类的可用性以及整个项目的商业可行性。原本存在的、针对载体衣壳蛋白的高滴度中和抗体会中和载体并阻碍其有效转导。此外，与其他基于蛋白质的治疗方法类似，转基因蛋白的中和抗体可能会通过中和其在体内的功能来限制对该转基因药理学的充分且准确的评估。

与人类类似，大型动物(特别是NHPs或犬)也会广泛接触AAV，因此可能存在与用于治疗开发的AAV血清型发生交叉反应的抗体。在临床环境中，特定AAV血清型在目标人群中的高血清阳性率可能会限制这种载体开发的经济可行性。

中和抗体检测广泛用于评估抗体的体外中和活性，方法是确定抑制50%或更少体外细胞转导所需的血清稀释度。通常情况下，中和抗体滴度大于1:5的动物和患者会出现明显的组织转导抑制现象，那么他们会被排除在研究之外。

基因治疗产品的表征

临床前项目设计中的一个关键考虑因素是开发检测方法以评估测试产品的滴度和效力，并显示所生产的产品批次间的可比性。在安全性和有效性研究中，应建立一种用以记录动物给药剂量的检测方法。研究者需要确定这些测定方法与用于确定人类给药剂量的检测方法之间的可比性。

药品效力评估可以通过体内或以细胞为基础的体外试验来完成。PCR可定量载体基因组滴度，提高正确表征有效和无效产物的能力，但也存在局限性。可以考虑应用替代或多重正交试验来评估效力，例如检测颗粒数，UV260/280蛋白与核酸的比例，以及对空衣壳与完整衣壳的评估。

各种与工艺相关的杂质需要被表征和量化。与其他疗法类似，临床前研究中使用的测试产品应具有与进入临床研究的产品相当或更高浓度的杂质。应表征的工艺相关杂质类型包括表面活性剂、核酸酶、抗生素、纯化试剂、残留质粒DNA、宿主细胞DNA和蛋白质。

Penaud-Budloo等人详细介绍了4种不同的AAV生产方法。如果生产方法在临床项目进行期间发生变化，则需要了解这些生产方法在载体质量、不同潜在污染物或与工艺相关的杂质、以及感染性与非感染性颗粒在比例方面的差异，从而建立产品可比性。如果生产工艺发生改变，可能需要进行过渡性的安全和疗效研究。

剂量选择

剂量外推和设计临床前研究以确定安全且生物学合理的剂量递增方案是关键的考虑因素。细胞和基因治疗产品特有的伦理考虑决定了临床研究中的起始剂量需要具有提供治疗益处的潜力，因为亚治疗剂量水平将导致中和抗体的产生，从而阻止进一步的再次给药。因此，起始临床剂量应对患者有一定的潜在益处，然后根据最大有效剂量和临床前研究的安全性特征来设计剂量递增方案。

临床前毒理学中的剂量选择通常会包括临床前药效模型中确定的最小有效剂量和最大有效剂量。毒理学研究中的高剂量将是预期最大有效剂量的倍数。通常需要10倍的倍数，如果10倍不可行，则可采用最大可行剂量(EMA指南)。最大可行剂量将根据载体的配制浓度和可递送至测试系统的体积来定义。

剂量外推可能因靶器官和ROA不同而有所差异。通过静脉给药的产品剂量通常是根据每千克体重所需的病毒基因组滴度来计算和推断。另一方面，考虑到眼睛大小和容量有限，针对眼睛可能需要固定的剂量。对于中枢神经系统（central nervous system，CNS），剂量则是根据组织或脑脊液（cerebro-spinal fluid，CSF）的体积进行推断的。

生物分布

由于从体外到体内以及从动物到人类的可转化性与开发新型AAV载体衣壳和转基因表达构建体有关，因此建议开展较小规模的探索性阶段研究，以评估该载体在两种临床前动物物种中的广泛生物分布。通常利用临床前药理学动物模型(如小鼠疾病模型)和正常NHPs来了解非啮齿动物中AAV载体的生物分布。如果在临床前项目中考虑使用NHPs以外的非啮齿动物物种，则应在剂量外推和治疗余量考虑策略中明确物种间的载体趋向性差异。

虽然使用模拟预期临床试验产品的组织特异性启动子既直观又合理，但在载体表征的早期阶段，使用能够无限制表达转基因的独立、普遍存在的启动子也可能有所帮助。利用这种构建体进行广泛的组织评估，有助于研究人员充分了解载体DNA的最大潜在生物分布。探索性研究的结果可以帮助指导监管阶段研究的设计，包括组织收集分类、选择适当的中期和终末期尸检时间点，以评估载体的最大生物分布、最大转基因表达以及载体DNA和转基因表达的持久性。这一点至关重要，因为在监管指导文件中未明确组织收集标准，因此，需要经验证据来确定和证明靶组织和潜在的脱靶组织清单，这些组织可能会在预期的主要器官清单之外带来安全性问题。此外，应收集尸检时肉眼观察到的病变，进行组织病理学评估以及载体的DNA评估。评估载体DNA和转基因(mRNA或蛋白质)产物的评估对特定测试品的有效性和安全性至关重要。监管指南要求使用经GLP验证的定量PCR(qPCR)检测方法来评估载体DNA的生物分布，其灵敏度应能检测到＜50个载体拷贝/1 μg基因组DNA。从监管角度来看，符合科学要求的逆转录PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)检测方法足以评估转基因mRNA。

基于形态学的生物分布

增加基于形态学的方法，如用于评估测试药品相关核酸(DNA和RNA)的ISH和用于评估转基因蛋白的IHC，这对于了解组织内的细胞分布情况至关重要，并可提供独特的见解，进而影响在可能具有独特生理功能的细胞类型中表达特定转基因的安全性考虑。

在表达转基因的细胞较少的情况下，AAV载体DNA和转基因表达(mRNA或蛋白质)可能存在脱节(作者未发表的数据，图1)。虽然qPCR和RT-PCR可分别对载体DNA和转基因mRNA进行精确定量，但这些检测方法缺乏必要的细胞背景，无法了解载体的趋向性，也无法在单细胞水平上评估DNA和mRNA。通过荧光报告或IHC检测报告蛋白或带标签的转基因蛋白产物，以及通过ISH检测DNA和mRNA，对生物分布进行基于形态学的评估，补充并增加了生物分布评估的空间背景，从而将某些研究结果与细胞特异性和组织特异性载体扩散联系起来。基于形态学的评估可能可以提供低载体DNA和转基因mRNA拷贝数的生物学相关性，这些拷贝数仅限于少数具有重要生理功能的细胞。

图1 食蟹猴注射AAV后，采用Visiopharm newCAST软件分析猴肝脏中载体DNA阳性细胞数量

（图片来源：Assaf BT, Whiteley LO, Toxicol Pathol, 2018）

未来发展方向

如图2所示，在设计基因治疗临床前安全方案以及与监管机构沟通交流期间，有几个要点需要考虑，包括了解不同物种的载体衣壳生物学特性、优化转基因表达构建体、使用组织特异性或普遍存在的启动子、根据预测的最小和最佳有效剂量选择毒理学研究的剂量，以及最后与监管机构的关键讨论点。

为了以更可行和更具成本效益的方式开发基因治疗产品，可能有机会简化和加速临床前毒理学计划。一旦对载体血清型、表达构建体、启动子、给药途径和剂量水平进行了评估，针对相同或不同疾病的相同靶组织递送其他的转基因，就可以减少临床前安全方案的范围，因为临床前安全性方案的重点是评估仅与转基因和疾病状况相关的特定风险。可缩短的安全性项目的具体方面包括：研究持续时间、减少研究的中期时间点、使用一种物种(例如仅啮齿动物)以及减少终点数量。

图2 基因治疗临床前安全性设计及与监管机构沟通交流期间需要考虑的要点的概述

（图片来源：Assaf BT, Whiteley LO, Toxicol Pathol, 2018）

原文链接：
https://journals.sagepub.com/doi/10.1177/0192623318803867?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub0pubmed