腺相关病毒（AAV）载体是基因治疗的首选载体之一，可以实现“一次给药，终身治愈”。然而，从AAV介导的基因治疗的临床试验中可以看到，在相同载体剂量下，治疗性蛋白的表达在个体之间存在广泛的差异。此外，从临床前数据中预测在人体内的有效治疗剂量范围仍存在困难。因此，在注射AAV后需要临床可转化的方法来调节转基因表达。RNA干扰（RNAi）是一种通过内源性miRNA或外源性siRNA/shRNA降低mRNA表达的进化保守机制。目前已经批准了五种RNAi药物，并有其他几种药物正在临床开发中。在肝脏中，代谢稳定的siRNA与GalNAc的皮下递送可有效沉默基因表达，且具有良好的安全性和耐受性。最近的研究还扩大了siRNA递送到非肝组织的范围，在中枢神经系统、眼睛和肺中表现出广泛的分布和持久的靶基因抑制。RNAi技术中的新开关设计可以使用化学稳定的siRNA来实现精确而灵活的剂量控制，不需依赖内源性miRNA。稳定的shRNA可用于长期基因补充治疗。使用抗毒剂REVERSIR可以控制RNAi活性，从而反转转基因的沉默状态。REVERSIR的发展成为RNAi活性的解药，支持其在治疗环境中的潜在应用。因此，RNAi技术可用于调节AAV介导的基因治疗的转基因表达，具有应用潜力。

近日，来自于Alnylam Pharmaceuticals的研究团队在Nature Communications上发表了题目为RNAi-mediated rheostat for dynamic control of AAV-delivered transgenes的文章。文章主要研究了利用RNAi技术开发分子开关来控制基因治疗中治疗性转基因的表达，这对于基于AAV的基因治疗具有重要意义。研究人员设计了一种RNAi调节器，使用化学修饰的siRNA结合物或shRNA表达载体靶向肝细胞以沉默AAV转基因表达。而为了诱导转基因的表达，他们使用REVERSIR技术，即合成高亲和力的寡核苷酸与siRNA或shRNA引导链互补，以逆转RNAi活性并迅速恢复转基因表达。他们还报告了具有潜在临床应用价值的siRNA序列，这些序列可以在尽量减少意外的脱靶效应的同时选择性地调节转基因的表达。这些结果为RNAi调节开关的概念奠定了基础，这对于动态调节基因治疗的表达并实现临床少量给药具有潜在应用价值。

在载体化shRNA控制下REVERSIR介导的转基因诱导

本研究旨在探讨使用可逆RNAi技术(REVERSIR)调节AAV载体中转基因表达的基因治疗方法。通过体外和体内实验验证了该自我调节的AAV载体系统的有效性，插入TTR shRNA可实现基因表达的抑制。实验表明22-mer TTR REVERSIR可以恢复转基因表达，LNA和PS含量低的TTR REVERSIR可以更快地恢复基因表达。该基因治疗方法在自我调节的基因表达方面具有潜在的临床应用。

图1 使用REVERSIR从shRNA调节的自沉默AAV载体诱导转基因

运用REVERSIR对shRNA调控的促红细胞生成素转基因进行体内控制

为证明REVERSIR单一制剂策略可以用于控制生理相关的转基因，研究人员设计了一种嵌入TTR shRNA的AAV载体，编码小鼠促红细胞生成素(mEpo)。采用TTR REVERSIR可以完全恢复mEPO表达，并且持续至少28天，而使用不稳定的REVERSIR则导致mEPO浓度短暂的剂量依赖性增加。这些结果表明，该单一制剂策略涉及AAV转基因的稳定自我抑制，可以通过外源性给予REVERSIR进行短暂或长期的表达逆转。

图2 REVERSIR介导的促红细胞生成素转基因调节

通过REVERSIR阻断外源性siRNA活性进行转基因诱导

研究人员使用AAV8载体探究外源性给药的GalNAc-结合siRNA和REVERSIR对AAV表达的需求调节。结果显示单次给予GalNAc-TTR siRNA能剂量依赖性地减少AAV驱动的血清GLuc表达，最高剂量9mg/kg显示出71%的沉默率。随后给予一次单分子等效剂量的TTR或NT REVERSIR，TTR REVERSIR能有效抵消9mg/kg siRNA引起的沉默活性，使GLuc的表达达到与对照组相似水平，可持续至少4周。实验结果表明，GalNAc结合的siRNA和REVERSIR的外源性给药是一种可推广的策略，可在AAV转导后按需调控转基因表达。

图3 通过外源性递送siRNA和REVERSIR体内调节AAV递送的转基因表达

鉴定有效和特异的转基因调节器siRNAs

作者鉴定了三个具有高度选择性的转基因调节器siRNA（TR-siRNA）序列，这些序列设计几乎不与已注释的转录本具有序列互补性，避免了对内源性转录组的影响。实验结果表明，这三个TR-siRNA都展示了显著的剂量依赖性作用。在大鼠中的毒理学实验证实了它们的高度靶向特异性和良好安全性。因此，这些TR-siRNA序列可以作为一种可靠的外源转基因调节剂使用。

图4 转基因调节siRNA序列的靶向和脱靶活性的体外表征

基因治疗的一个主要难题是缺乏控制治疗性转基因剂量的普适方法。RNA分子开关具有调节AAV基因表达潜力，可通过RNAi控制AAV递送的载体剂量。这种方法可以动态、持续、可逆地实现治疗效果，避免基因过度表达所引起的不良反应，且具有较少的给药次数的优势。RNAi方法可以动态地修改转基因表达，避免潜在的剂量过量风险，具有独特的实用性。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-37774-5